一种尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物体外诊断技术领域，具体涉及一种尘螨特异性IgG4亚型抗体校 准品及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 研宄发现，在进行尘螨脱敏治疗后，患者血清中尘螨特异性IgG4亚型抗体水平显 著上升（P〈0. 0001)。诱导产生的尘螨特异性IgG4亚型抗体水平的升高，在特异性免疫治疗 过程中发挥了重要的作用，可通过检测特异性IgG4抗体水平对脱敏治疗效果进行评价。目 前，体外诊断是脱敏疗效检测的常用方法。在生物制品的标准化、质量控制和效力评价中校 准品是体外诊断试剂评价的标尺，起着非常重要的作用。
[0003] 然而目前国际、国内均没有尘螨特异性IgG4亚型抗体的校准品，这给实际研宄工 作和临床检验工作带来很多不便。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品（校准物质），用于 标定尘螨特异性IgG4亚型抗体的含量，从而判断脱敏治疗疗效。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种尘螨特异性IgG4亚型抗体校准 品，所述校准品中尘螨特异性IgG4亚型抗体蛋白浓度为lug/mL，尘螨特异性IgG4亚型抗体 蛋白纯度多95wt%，其制备方法包括以下步骤：
[0006] (1)候选血清的制备：对临床适应症为过敏的病人进行脱敏治疗之后，无菌采取 血液并收集到无菌的采血管中，在室温条件下静置，待血清析出后，取上清，离心分离血清， 作为候选血清；
[0007] (2)候选物的筛选：通过法玛西亚UniCap检测系统对候选物进行尘螨特异性IgG4 抗体检测，尘螨特异性IgG4亚型抗体高阳血清（多0.lmg/mL)作为候选物；
[0008] (3)尘螨特异性IgG4亚型抗体的提取与纯化：
[0009] 1)尘螨亲和层析纯化，将筛选出的候选物经过尘螨亲和层析柱上样，洗杂，洗脱， 收集洗脱后的蛋白吸收峰组分；
[0010] 2)抗人IgG4亚型抗体亲和层析柱纯化，将步骤1)洗脱后所得的蛋白吸收峰经抗 人IgG4亚型抗体亲和层析柱上样，洗杂，洗脱，收集得第二次蛋白吸收峰组分；
[0011] 3)分子筛层析纯化，将洗脱后的蛋白吸收峰经分子筛层析柱上样，洗脱，收集得第 三次蛋白吸收峰组分；
[0012] 4)浓缩、除菌、蛋白浓度测定、蛋白纯度鉴定，将洗脱后所得的三次蛋白吸收峰组 分经离心超滤浓缩后，通过直径为0. 22ym的微孔滤膜除菌后，得尘螨特异性IgG4亚型抗 体提纯物，并采用凯氏定氮法检测蛋白浓度、通过SDS-PAGE测定蛋白纯度；
[0013] (4)校准品的分装、冻干、熔封：
[0014] 1)配制冻存液，在磷酸根摩尔浓度为0.01mol/L，Tween20体积分数为1%。，pH= 7. 2?7. 4的PBST缓冲液中加入酪蛋白和核糖，使酪蛋白的质量分数为0. 5?5%，核糖的 质量分数为1?10%，得冻存液；将所得冻存液用微孔滤膜进行抽滤，得抽滤冻存液；
[0015] 2)将所得尘螨特异性IgG4亚型抗体提纯物用制得的抽滤冻存液稀释至1yg/mL， 得所述尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品；
[0016] 3)将所得标准浓度蛋白溶液进行无菌分装，并用铝箔纸封口后在-80°C温度下过 夜；
[0017] 4)过夜后在铝箔纸上扎小孔，进行真空冷冻干燥、熔封，得所述冻干尘螨特异性 IgG4亚型抗体校准品。
[0018] (5)冻干尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品的鉴定：
[0019] 1)物理性状检验；
[0020] 2)无菌检验、真空度检验，按照《中国药典》的规定方法进行检验；
[0021] 3)剩余水分测定，按照《中国药典》的规定，以真空烘干法进行剩余水分测定，应不 超过标准规定的4% ;
[0022] 4)均一性检验，随机抽取规定数量的样品，使用免疫球蛋白G4测定试剂盒（散射 比浊法），注册号为国食药监械（进）字2014第2400357号，进行标定，实验结果应一致。
[0023] 5)稳定性试验，采用热加速稳定性试验方法，检查在高温条件下样品放置的时间， 并以此数据作为依据，为下一批稳定性试验作基础。
[0024] 6)定值（协作标定），选择3个以上具有对血清学试验有经验的实验室或医院检 验科，每个实验室使用3个样品，每个样品重复2次，各协作标定单位按照协作标定方案的 要求，使用免疫球蛋白G4测定试剂盒（散射比浊法），注册号为国食药监械（进）字2014 第2400357号，进行标定，并将实验结果交给组织单位。
[0025] 根据上述方案，所述尘螨亲和层析柱所用胶凝为经尘螨致敏蛋白偶联的 CNBR-activatedSepharose4B溶胀基质。
[0026] 根据上述方案，所述尘螨亲和层析纯化步骤为：将筛选出的候选物经尘螨亲和层 析柱上样，上样量为经尘螨致敏蛋白偶联的CNBR-activatedSepharose4B溶胀基质体积 的8倍；在洗脱前，用10倍柱体积PBS缓冲液洗柱，使A280值恢复到基线或本底水平；然 后进行洗脱，用5?10倍体积的0. 05M，PH为4. 0的醋酸钠-醋酸缓冲液洗脱结合的蛋白； 汇集A280彡0. 2的峰组分，得蛋白吸收峰组分。
[0027] 根据上述方案，所述抗人IgG4亚型抗体亲和层析柱所用胶凝为经抗人IgG4抗体 偶联的CNBR-activatedSepharose4B溶胀基质。
[0028] 根据上述方案，所述抗人IgG4亚型抗体亲和层析纯化步骤为：将洗脱后的蛋 白吸收峰组分经抗人IgG4亚型抗体亲和层析柱上样，上样量为经抗人IgG4抗体偶联的 CNBR-activatedS印harose4B溶胀基质体积的8倍；在洗脱前，用10倍柱体积PBS缓冲 液洗柱，使A280值恢复到基线或本底水平；然后进行洗脱，用5?10倍体积的0. 05M，PH为 4. 0的醋酸钠-醋酸缓冲液洗脱结合的抗体蛋白；汇集A280多0. 2的峰组分，得第二次蛋 白吸收峰组分。
[0029] 根据上述方案，所述分子筛层析纯化步骤为：以葡聚糖凝胶S印hadexG75为分 子筛层析柱所用胶凝，将洗脱后的二次蛋白吸收峰组分经分子筛层析柱上样，上样量为 S印hadexG75体积的8倍；在洗脱前，用10倍柱体积PBS缓冲液洗柱，让A280值恢复到基 线或本底水平；然后进行洗脱，用5?10倍体积的PBS缓冲液洗脱；汇集A280彡0. 2的峰 组分，得第三次蛋白吸收峰组分。
[0030] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0031] 1)本发明通过采集临床过敏病人进行脱敏治疗之后尘螨特异性IgG4亚型抗体检 测阳性的血清作为候选血清，通过效价筛选，然后进行尘螨特异性IgG4亚型抗体的进行提 取、纯化并采用冻存液替换稀释血清基质来制备所述尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品，制 得的校准品纯度高、稳定性好，可有效判断脱敏治疗的疗效。
[0032] 2)本发明为了保证该校准品的均一性和稳定性，采用冻存液替换血清基质，再通 过真空冷冻干燥法制备冻干尘螨特异性IgG4亚型抗体校准品，进一步保证制得校准品的 均一性和稳定性。
[0033] 3)本发明涉及的制备方法科学、严谨、完善，按照校准品制备程序使每一个步骤科 学严谨，经过协作标定，数据统计，保证效价定值准确。
【具体实施方式】
[0034] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限 定本发明。
[0035] 以下实施例中，所述尘螨亲和层析柱中所用凝胶为经尘螨致敏蛋白偶联的 CNBR-activatedSepharose4B溶胀基质，其制备步骤为：称取 0.lgCNBR-activated Sepharose4B基质干粉，悬浮于ImM的HC1中，基质迅速溶胀后用ImM的HC1洗柱15min， 每克干粉用 200ml，ImM的HC1，得CNBR-activatedSepharose4B基质；将 1. 5mg尘螨致敏 蛋白溶解到〇. 5mL，0. 1MNaHC03(PH为8. 3,NaCl含量为0. 5M)的偶联液中；将含有尘螨致 敏蛋白的偶联液与制备好的CNBR-activatedSepharose4B基质混合，并在4°C条件下翻 转过夜；用至少5倍体积的偶联液洗掉多余的尘螨致敏蛋白；用0. 1M的TRIS-HC1缓冲液 (PH为8. 0)封闭基质上的CNBR活性集团；用至少5倍体积的0. 1M的醋酸钠-醋酸缓冲液 (P