一种采用在体心脏灌流对鱼类脑组织标本固定的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物领域，特别涉及一种动物组织标本固定方法。
【背景技术】
[0002]心脏灌流方法是对动物脑组织进行组织切片、病理标本制作、免疫组化、原位杂交、原位PCR、脑内定位标记等研宄的技术基础。动物在体心脏灌流技术是一种组织标本前固定方法，是在动物被麻醉的情况下，用固定液进行心脏灌流的方法。
[0003]动物脑组织在死亡后由于细胞内溶酶体酶的作用很快会发生自溶现象，心脏灌流的目的在于在动物死亡前应用固定液对脑组织进行固定，抑制组织中细菌的繁殖，防止腐败，避免脑组织自溶现象的发生，还可以增加组织硬度，使组织不易变形，维持原有的组织形态结构，得到形态完整和状态良好的脑组织，并且固定后的组织对染料有不同的亲和力，染色后可产生不同的折射率，颜色更为清晰透明，便于观察硬化组织，更有利于组织切片的观察。
[0004]目前的在体心脏灌流技术大多应用于陆地动物。
[0005]季正剑等(季正剑，张冬霞，张立波，等.大鼠在体脑组织灌流方法的比较[J].实验动物与比较医学，2009, 29(6):390-392.)采用不同的方式对大鼠进行灌流的比较研宄，筛选出最佳的灌流技术，即心尖进针结扎腹主动脉组，从心尖位置朝向主动脉插人灌流针，通过左心室直至主动脉；打开腹腔，结扎腹主动脉；剪开右心耳，插入聚乙烯管，用以液体回流。
[0006]专利号CN 1336540A公开了一种采用心脏灌流法去除组织内红细胞制备分散的细胞悬液的方法，对小鼠采用从左心室心尖注射灌流液，从右心室流出的方法进行灌流。
[0007]刘乃慧等(刘乃慧，张莉，邵颖，等.在体心脏灌流技术在大鼠脑组织切片观察中的应用[J].实验动物科学与管理，2005 (2)，52-53.)选用SD大鼠进行腹腔注射麻醉，打开腹腔，从左心室插入灌流针并固定，剪开右心耳，用恒流泵进行灌注。
[0008]胡萍等(胡萍，尤家騄，罗正曜.大白鼠心脏再灌流综合征模型[J].湖南医学院学报，1986，01:15-18.)通过结扎大白鼠左冠脉主支然后解除结扎，复制了大白鼠在体心脏再灌流综合征模型。
[0009]李靖等(李靖，萧家思，侯岷.烧伤对豚鼠离体灌流心脏收缩及舒张功能的影响[J].第三军医大学学报，1990，06:480-483.)利用顺行洼离体灌流心脏模型观察烧伤对心脏收缩及舒张功能的影响。
[0010]马晓乐(马晓乐.甘肃鼢鼠脑图谱构建的研宄[D].陕西师范大学，2009.)在构建鼢鼠脑图谱研宄中采用从左心室插入主动脉，右心房开口的方式进行了心脏灌流，注入固定液的量约为体重的1.5倍。
[0011]通过比较上述文献心脏灌流方法可知，由于动物的物种差异性和研宄目的性不同，导致心脏灌流的方法也不同。
[0012]水生动物与陆地动物有较大的形态与生理差异，针对鱼类的心脏灌流技术少有文献报导。以鲤鱼为例，鲤鱼心脏只有一心室和一心房，血液循环为单循环，无体循环与肺循环之分，其血液循环路线与其他动物不同，进针位置和方法以及使用的固定液等也有所差异，而且鲤鱼与大鼠、大壁虎等陆地动物的麻醉方法也不同，因此心脏灌流技术流程必定不同。
【发明内容】
[0013]本发明的目的在于提供一种能够解决鱼脑标本固定中存在的组织自溶问题的采用在体心脏灌流对鱼类脑组织标本固定的方法。
[0014]本发明的技术方案主要是:药浴法将鱼麻醉，开胸手术，将灌流针经心室插入腹大动脉进行插管并结扎固定；将引流针经心房进行总主静脉插管并结扎固定；将引流针连接的流出管放入刻度烧杯中，实时计量并监控灌注液与流出液的体积；在心脏灌流开始时，在颅骨上划四根直线形成长方形，做长方形切口，打开颅腔，暴露出脑；当鱼脑颜色变白且体积有所增大时，并结合灌注液与流出液的量来决定灌注时间；停止灌注后，摘取鱼脑置于固定液中进行固定。
[0015]本发明的具体步骤如下:
[0016](I)麻醉动物:采用药浴法麻醉鱼，即将麻醉药物泡入鱼活动的水中，麻醉药物就会通过鱼的鲍部吸收而进入到血液中，实现鱼的镇静或麻醉。
[0017](2)开胸手术:结合鱼的生理和解剖特点，在鱼的心脏体表投影区域附近开胸，用手术刀从鱼腹鳍前端与体轴垂直方向交点开始沿腹中线向前经胸鳍剪至下颁处，再用剪刀沿腹鳍前的开口向背方剪到脊柱，沿脊柱下缘剪到鳃盖后面，除去左侧肌肉，打开胸腔的心脏体表投影区域，保留鳃盖，暴露出心室、腹大动脉、心房、总主静脉。
[0018](3)双管插管:进行经心室的腹大动脉插管，用手术线结扎腹大动脉固定灌流针，经心房进行总主静脉插管，手术线结扎总主静脉固定引流针。
[0019](4)心脏灌流:在完成插管并固定后，再将鱼固定，将灌流针连接的灌流管通向恒速灌注泵，将引流针连接的流出管放入刻度容器中，实时计量并监控灌注液与流出液的体积，开启恒速灌注泵进行心脏灌流，先灌注生理盐水置换血液，后灌注浓度为10%福尔马林溶液。
[0020](5)开颅手术:在心脏灌流开始后，根据鱼颅骨的结构特点和尺寸，立即以鱼嘴至头部与躯干交接处即头部与躯干第一片鱼鳞交界点为参照点，与头部正中线垂直方向用钝物划一直线，以左右眼眶上边缘为基准，平行于正中线各划一直线，以左右眼眶后边缘为参照点垂直于正中线划一连线，四条直线相交形成长方形，沿四根直线在颅骨上做出长方形切口，打开颅腔，去除脑表面的脑脊液和脂肪组织，暴露出脑组织。
[0021](6)停止灌注:当观察到鱼脑的颜色变白且体积有所增大时，灌注的福尔马林的量为鱼体重的1.5倍时，停止灌注，立即摘取鱼脑组织放置于10%福尔马林溶液中进行标本固定48小时。
[0022]本发明与现有技术相比具有如下优点:
[0023]1、能够有效解决鱼类脑组织的固定不充分、固定区域不全面、组织自溶、细胞变形等问题，容易获得结构更完整及状态更理想的脑组织标本，能够更好地保留其自然形态，可很好应用于脑组织切片的制作、染色、标记等方面；
[0024]2、能够有效避免出血过多、损伤过大，可以较为容易的寻找到插管位置；
[0025]3、所采用的插管及结扎方法能够将灌流针和引流针进行有效固定，防止在移动鱼体时出现脱落；
[0026]4、灌流过程中进行开颅观察可以更为准确的判断灌流效果并可以在灌流停止后快速提取脑标本，结合流出液体的颜色及流出量能够有效确定灌流停止时间。
[0027]5、可为组织切片、病理标本制作、免疫组化、原位杂交、原位PCR、脑内定位标记等方面的应用提供新技术。
【附图说明】
[0028]图1是鲤鱼心脏灌流实验图；
[0029]图2是用常规方法未心脏灌流制作的脑组织切片图；
[0030]图3是用本发明进行心脏灌流制作的脑组织切片图；
【具体实施方式】
[0031]实施例1
[0032]实验动物:健康成年鲤鱼，体重1.13kg，体长36.52cm，购于秦皇岛市水产市场。
[0033]主要试剂:丁香酚(上海医疗器械股份有限公司齿科材料厂，批号201103)，生理盐水、蒸馏水、中性红、中性树胶、石蜡、二甲苯、无水乙醇、10 %福尔马林溶液、2 %盐酸溶液。
[0034]主要仪器:BQ50S微流量调速型蠕动泵(保定雷弗流体科技有限公司)、7002模具电磨(永康市喜克莱工具有限公司)、RM2235型组织切片机(德国Leica公司)、TS100型倒置生物显微镜(日本Nikon公司)、HH-S型数显恒温水浴锅(金