一种基于全内反射的暗场照明方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及显微成像的照明方法，具体来说，涉及一种暗场照明的方法，特别是利用全内反射棱镜和样品池的全内反射实现对样品池中微纳米颗粒和生物样品的观测和研宄，并且可以广泛灵活应用于现有显微镜或者自建成像系统。
【背景技术】
[0002]成像技术的基于传统的光学成像显微镜结合新的激光技术发展成现在广泛应用的荧光显微镜，同时随着生物分子学和纳米材料科学等的发展，研宄的对象由微米尺度向纳米尺度的递进，更高分辨率和信噪比的技术手段成为影像学不断追求的目标。最近纳米贵金属颗粒、碳纳米管、量子点等具有特殊性质的纳米材料被广泛应用到合成催化、光电器件、纳米载药和生物影像等领域。例如纳米金颗粒具有特殊的等离子体吸收和散射等光学特性、表面易于化学修饰、具有优良生物相容性等特点，被广泛应用于生物等领域，但是由于纳米材料尺寸远小于可见光的波长时，超过了普通显微成像的衍射极限，用传统的显微术无法直接观察纳米级颗粒成像。因此在成像方面暗场照明技术利用了纳米颗粒自身散射性较强的光学特性，非常适用于观察纳米尺度材料。
[0003]暗场照明技术在原理上应用了光学上的丁达尔效应，当照明光束进入溶胶时，在照明光的传播过程中，光线与颗粒作用沿着不同方向按一定统计规律被散射可以偏离原来的方向，每个微粒就成为一个发光点，从侧面可以看到一条光柱。通用的暗场照明显微成像技术一般采用斜射照明并利用环形光阑挡住中心的直射照明光，因此照明使用的聚光镜的数值孔径必须要大于成像物镜的数值孔径才能使照明光不能通过聚光器直接进入物镜，而只能从聚光器的光阑四周边及未遮暗的部位斜射到样品池中的样本上。因照明光线是斜射且角度大于物镜的采集角度的，不能进入物镜，故由显微镜观察到的视野背景是暗的，只能看到因光散射作用而使样品发出亮光，从而实现样品的暗场观测。由于滤除了直射光，采集的只是样品池中颗粒的散射光，因此暗背景情况下可以有效的提高信噪比。单颗粒的光散射在溶液中，横向照明光束截面的尺度比颗粒要大得多，所以入射波可以近似为平面波，又由于微粒间距离很大，因此可以看成是单颗粒对平面波的散射。散射光的空问分布反映颗粒本身的属性.不同大小、材料、形状的颗粒的散射光空间分布就有很大差别，可以通过严格的电磁理论计算，因此利用暗场成像可以有效提取观测样品的物理特性。一般适用于暗场照明的样品是相对分散度比较高，背景结构相对简单的薄的颗粒样品例如生物学中的硅藻、细菌、酵母、组织培养细胞、原生动物等。适用的非生物标本包括晶体矿物和化学，胶体粒子，包含小夹杂物和聚合物和陶瓷薄片，孔隙度差异，或折射率梯度。暗视野显微镜可以看到在明视场里看不到的样品，生物学上可以用于检查未染色生物标本的形态和运动能力。
[0004]但是与明场照明区别的是暗场照明的有效工作区域相对较短，当聚光镜固定时上移或者下移物镜的范围超过这一尺度的时候，由于照明光线的发散，会导致采集效率降低和成像质量的下降。而且由于聚光镜必须采用高数值孔径，放标本放置标本时在聚光镜前透镜与载物片之间常常使用浸油，明暗场切换需要更换聚光镜或者光阑，一般无法在实验中快速切换，并且由于照明的高数值孔径也限制了样品的厚度。所以样品和显微镜载物片的厚度收到很大限制，传统的暗场照明样品因此收到很大的限制。
[0005]另一种利用全内反射达到纳米级分辨率的技术是全内反射显微成像技术，通过利用光线全反射后在介质另一面产生衰逝波的特性，激发荧光分子以观察荧光标定样品的极薄区域，观测的动态范围通常不超过在200nm左右。因为经过全内反射后反射面一侧的激发光呈指数衰减，只有极靠近全反射面的样本区域会产生荧光反射，很大程度上降低了背景光噪声干扰观测标的，能帮助研宄者获得高质量的成像质量和可靠的观测数据。但是样品厚度和成像范围依然收到很大的限制。
[0006]本发明的目的是克服现有暗场以及全内反射倏逝场照明技术在样品厚度和成像范围等方面的不足，提供一种较低成本，易于实现的利用照明光与样品作用的散射特性成像的新型暗场照明方法。本方法可以实现上下两侧同时观察和激发等功能，结构简单能与现有成像、检测和激发系统结合，调节便捷，可以实现对厚样本中微纳米颗粒的照明，进而更加便于开展相关生物影像精确观测和胶体特性动态测量等研宄。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是克服现有暗场以及全内反射照明技术在厚尺寸样品等方面的不足，提供一种利用照明光的散射特性成像的可用于微纳米颗粒观测及研宄的方法。本方法可以实现上下两侧同时观察和激发功能，结构简单能与现有成像、检测和激发系统结合，调节便捷，可以实现对厚样本的照明，进而更加便于开展相关生物影像观测和胶体特性等研宄。
[0008]为达上述目的，本发明的一种基于全内反射的暗场照明装置，采用以下的技术方案:
[0009]一种基于全内反射的暗场照明装置，包括全内反射暗场照明显微镜，全内反射暗场照明显微镜包含载物台、上成像物镜、全内反射棱镜、下成像物镜，全内反射暗场照明显微镜的载物台上设有样品池，样品池上设有全内反射棱镜，样品池里装载样品金纳米颗粒的水溶液，全内反射暗场照明显微镜设有对称的上光路与下光路，全内反射暗场照明显微镜的上光路一侧设有上成像物镜，全内反射暗场照明显微镜的下光路一侧设有下成像物镜，全内反射暗场照明显微镜的上光路与下光路的成像面互相重叠在样品池的中待观察区域中；
[0010]全内反射暗场照明显微镜的上光路由上成像光电传感器、成像透镜B、滤光片A、上成像物镜组成，全内反射暗场照明显微镜上侧设有上成像物镜，上成像物镜远离全内反射暗场照明显微镜的另一侧前面设有成像透镜B，成像透镜B远离上成像物镜的另一侧前面设有滤光片A，滤光片A远离成像透镜B的另一侧前面设有上成像光电传感器，全内反射暗场照明显微镜的上光路发出的光束经过上成像物镜、成像透镜B、滤光片A照射到上成像光电传感器；
[0011]全内反射暗场照明显微镜下侧(下光路)设有下成像物镜，下成像物镜远离全内反射暗场照明显微镜的另一侧设有一个与光路成45度角的二向色镜，二向色镜侧面与下成像物镜光路垂直方向设有激光器，激光器与二向色镜之间设有扩束准直透镜组，激光器的光路经过扩束准直透镜组后通过二向色镜反射到达下成像物镜，聚焦在样品池。
[0012]进一步，在一些实施例中，所述全内反射的暗场照明装置还包含照明激光、全内反射暗场照明显微镜、全内反射棱镜、样品池。
[0013]进一步，在一些实施例中，所述二向色镜下方设有与之垂直的反射镜，反射镜侧面与下成像物镜光路垂直方向设有有成像透镜A和滤光片B，下成像物镜的成像光束经过二向色镜、反射镜、成像透镜A和滤光片B后，将放大的影像投射到下成像光电传感器上。
[0014]进一步，在一些实施例中，所述照明激光发出的激光经过全内反射棱镜全内反射照射到样品池中的微纳米颗粒的水溶液中，照明激光经过样品池池底的全内反射后再次进入全内反射棱镜，在全内反射棱镜中多次反射出射离开棱镜。
[0015]进一步，在一些实施例中，所述全内反射暗场照明显微镜的激发光路由激光器、扩束准直透镜组、二向色镜、下成像物镜组成，全内反射暗场照明显微镜远离下成像物镜的另一侧(上光路)设有上成像物镜；下成像物镜下面首先设有一个45度角放置的二向色镜，二向色镜偏转激光一侧是扩束准直透镜组