，被下成像光电传感器102采集。进入上成像物镜301的荧光或者散射光经过成像透镜B 203和滤光片A 401，被成像光电传感器103采集。
[0044]图2是全内反射梯形棱镜和样品池部件分开不例，全内反射棱镜302下面是样品池载玻片311，样品池载玻片311下面是样品池盖玻片312。
[0045]图3是全内反射梯形棱镜和样品池一体化加工实例，样品池304(梯形)设置在全内反射棱镜302中，样品池304下面设有样品池盖玻片312。
[0046]图4是全内反射弧形棱镜和样品池一体化加工实例，带全内反射棱镜302的样品池304 (弧形)，样品池304下面设有样品池盖玻片312。
[0047]在其中一个实施例中，基于常规或者自行设计的倒置荧光显微镜的成像功能模块和激发功能模块；放置于常规倒置荧光显微镜二维载物台上由照明激光、全内反射棱镜302、样品池304组成的照明功能模块；上成像光路可扩展功能模块。
[0048]系统的成像以及激发功能模块的配置是为了实现相关功能而必须配置的装置，主要由观测下成像物镜305、二向色镜104、反射镜105 (高反射率镜片)、成像透镜A 202 (成像消色差透镜)、滤光片B 402(带通滤光片)和下成像光电传感器102(带成像CCD或者CMOS相机)组成的成像光路；以及在二向色镜104分离的可包括连续或者脉冲激光器101，以及扩束准直透镜组201 (扩束透镜组)等组成的使得系统具备捕获或者激励等功能的激发功能模块。
[0049]照明功能模块作为发明的核心，主要包括激光以及附属调制模块，包括连续或者脉冲激光器、模式优化激光滤波的透镜针孔物镜、光路位移角度控制反射镜组以及吸收出射激光的吸收池或者发黑挡板；由高折射率材料加工成的导入激光，并使得照明激光303经过多次全内反射到达样品池304中心的全内反射棱镜302 ;样品池304主要是承载全内反射棱镜302并放置样品，其下底设有由0.17mm厚的样品池盖玻片312。
[0050]上成像光路可扩展功能模块由另一个观测上成像物镜301、成像透镜B 203 (成像消色差透镜)、滤光片A 401 (带通滤光片)和上成像光电传感器103 (带成像CXD或者CMOS相机)组成的成像光路。其设置主要是由需求而定，目的是增加一个维度观测系统，其配置与系统的成像以及激发功能模块在光学上并无差异。
[0051]在一些实施例中，全内反射暗场照明显微镜的主光路为成像装置，采集在全内反射暗场照明中样品的散射光，滤光片B 402为多层干涉膜或者光学玻璃，滤出激发光，采集散射光和焚光。全内反射暗场照明显微镜下光路的逆光束方向设有一个45度角的二向色镜104，二向色镜104在750nm到1050nm反射率高于95%，在350nm到680nm透射率大于5%，多层镀膜设计引入低色散。全内反射暗场照明显微镜300下光路从样品池304中透射过来并经过下成像物镜305 (聚焦物镜)出来的光束通过二向色镜104、反射镜105、成像透镜A 202、滤光片B 402后到达下成像光电传感器102，并在下成像光电传感器102 (成像装置)中完成实时成像。使用的激光器101的激光波长640-1060nm可调，带宽1nm的时候，飞秒的脉宽约为lOOfs，出光的功率约为1000mW，进入显微镜的功率为800mW。
[0052]观测上成像物镜301、下成像物镜305:物镜的NA为0.65，工作距离为4.5mm，可以连续校准O到2mm厚的盖玻片厚度或者硅片厚度。
[0053]使用的样品是溴化十六烷基三甲铵包被的直径60纳米的的金纳米球。样品的透射电镜图，金颗粒形状规整，大小基本均匀，尺寸略有差异，因此可以用来作为成像和研宄的对象。对应由于60nm颗粒共振散射激光谱的波峰在532nm左右，连续绿光532nm激光器，功率200mW，光功率稳定性波动小于3%，光斑模式ΤΕΜ00，M因子小于1.3。
[0054]不使用上成像光路的情况下全内反射棱镜302可以采用分光棱镜或者直角角棱镜，光束入射棱镜进入样品池304并在池底发生全内反射后再通过棱镜出射，棱镜的外形和尺寸可做相应修改。
[0055]全内反射棱镜302和样品池304可以一体化加工，样品池304底部利用样品池盖玻片312密封，专有设计减少了界面损耗。
[0056]全内反射棱镜302的材质应适用于能较理想的产生全内反射折射率应大于溶液，以水为例1.33，照明光波长的光学损耗低小于ldB/km，易于加工为选择标准，可以列举的有石英玻璃、K9玻璃等常用光学玻璃，甲基丙烯树脂、聚苯乙烯树脂、聚碳酸酯树脂、环烯烃树脂、甲基丙烯-苯乙烯共聚物树脂、环烯烃-链烯烃共聚物树脂、聚酯树脂等光学塑料，凡是可以满足以上条件的材料皆可以作为加工全内反射棱镜302的原料。
[0057]照明激光303可以是连续光，脉冲光；激光的波长范围包括紫外光，可见光，红外光等，波长的选择与被照明样品有关，同时也应与探测器和系统的兼容性保持一致。
[0058]一种基于全内反射的暗场照明方法，具体方法如下:
[0059]系统的搭建如图实验系统是基于一种倒置荧光显微镜，样品池304和全内反射棱镜302如图上下放置，侧面照明激光角度和位置可以在符合全内反射临界角度范围内调节，其中荧光激发的模块被替换匹配激发光的二项色镜，用于反射导入飞秒光束并透过照明光或者荧光，上光路装置按照需求搭建成像等系统。观测样品为金纳米颗粒，在实验前将4°C低温保存的60nm直径的金纳米颗粒溶液用去离子水或者蒸馏水稀释100?2000倍，然后超声5?1min后使用。
[0060]将配置好的金纳米颗粒溶液放置在超声清洗过的样品池中，用洁净的棱镜盖上密封，放置到显微镜的载物台的中心位置上。在明场条件下，找到样品池的底部，然后打开光电传感器将图像显示在电脑上，便于调节。
[0061]打开激光器，通过调节反射镜调整入射激光的角度和位置，使得激光经过棱镜后发生全内反射。微调节激光和样品池，使得激光刚刚入射到样品池中心的底部，在显示屏中可以观察到调节到合适位置。可以观察到，在合适的位置视野背景较低，主要是非成像面的颗粒和样品池等的散射光，再调整物镜位置，可以看到颗粒明亮的散射光。最后调整激光强度和光电传感器的参数等，得到合适的如图5的影像，可以清晰的分辨出液体中焦面上下的纳米颗粒。
[0062]在暗场全内反射照明条件下，可以观察到颗粒在溶液中的布朗运动，然后打开激光器，可以进一步进行双光子荧光激发或者光学微操控等研宄。
[0063]利用此发明能够实现对样品池中微纳米颗粒和生物样品等较厚样本的观测和研宄，能与现有成像、检测和激发等系统灵活结合，便于调节改造，同时保证了良好的适用性和兼容性，可以应用于生物影像观测和胶体特性等相关研宄领域。
[0064]以上所述实施例仅表达了本发明的部分实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1.一种基于全内反射的暗场照明装置，包括全内反射暗场照明显微镜(300)，所述全内反射暗场照明显微镜(