一种基于dna酶检测钾离子浓度的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体涉及一种基于DNA酶检测钟离子浓度的方法。
【背景技术】
[0002] 人体内的钟是维持细胞生理活动的主要阳离子，是保持机体的正常渗透压及酸碱 平衡，参与糖及蛋白质代谢，保证神经肌肉的正常功能所必需，其含量是人体生理活动的重 要指标。尿液、血清中钟离子的含量水平在临床上可用了诊断一些肾脏、也脏等方面的疾 病。
[0003] 正常情况下，人体的钟离子浓度有一个合理的参考范围，如血清中；3. 5? 5. 5mmol/L ;尿液中25?125mmol/2化。当钟离子含量高于参考值时，表现出高钟症，其原 因主要有：急性肾功能衰竭、严重溶血或组织损伤、急性酸中毒或组织缺氧、肾上腺皮质功 能减退、酵固丽缺乏、长期应用利尿剂、家族性高血钟等。血清钟高还可引起严重的肌肉、也 肌和呼吸功能的抑制性应激奈乱，W及特异的也电图改变。血清钟高于7mmol/L时，就有该 些现象出现，超过lOmmol/L时，即可发生也室纤颤，也脏停搏而导致死亡。反之，当钟的摄 入量不足、钟丢失严重、肾脏疾病转入多尿期等情况时则会出现低钟症。
[0004] 现有技术中测定钟离子浓度的方法主要有：中子活化法、同位素稀释质谱法、化学 测定法、火焰光度法、离子选择电极法、酶动力学法、原子分光光度法等。目前，临床上经常 使用的方法是火焰光度法和离子选择电极法。
[0005] (1)火焰光度法：火焰光度法是一种发射光谱分析法，利用火焰中激发态原子回 降至基态时发射的光谱强度进行含量分析，可检测血清、尿液、脑脊液及胸腹水的Na+和K+， 该方法属于经典的标准参考法，优点是结果准确可靠，广为临床采用。通常采用的定量方法 有外标准法和内标准法。外标准法一般操作误差较大，不常采用。内标法是标本及标准液 采用加进相同浓度的内部标准元素进行测定，一般是加入裡内标，测定的是裡/钟电流的 比值，而不是单独钟的电流，该样，可减小燃气和火焰温度波动等因素引起的误差，因而有 较好的准确性。
[0006] (2)离子选择电极法（ISE法）；在专用仪器上进行血清和尿液的钟、轴离子测定。 因其具有标本用量少，快速准确，操作简便等优点，是目前所有方法中最为简便准确的方 法，几乎有取代其他方法的趋势。其原理是；离子选择电极是一种电化学传感器，其结构中 有一个对特定离子具有选择性响应的敏感膜电极，将离子活度转换成电位信号，在一定范 围内，其电位与溶液中特定离子活度的对数呈线性关系，通过与已知离子浓度的溶液比较 可求得未知溶液的离子活度，按其测定过程又分为直接测定法和间接测定法，目前大部分 采用间接测定法，由于间接测定法将待测样本稀释后测定，所测离子活度更接近离子浓度。 目前主要的电极种类有；玻璃膜电极，感应材料为玻璃膜；固相电极，由难溶金属物质加压 成型；液态膜电极，将环氧树脂或内装聚氯己帰作为感应膜；额氨霉素膜制成的r电极。该 些电极都具有一定寿命，使用一段时问后，电极会老化，且价格昂贵。
[0007] (3)化学测定法：目前r的化学测定主要利用复环王冠化合物如穴冠離或球冠 離，亦称为冠離，均为离子载体进行测定，由于大环结构内有空穴，分子内部氧原子有未共 用电子对可与金属离子结合，根据空穴大小，可选择性结合不同直径的金属离子，从而可达 到测出离子浓度的目的。
[0008] (4)酶法；酶法测定钟的原理是利用对丙丽酸激酶的激活作用，后者催化磯酸帰 醇式丙丽酸变为乳酸同时伴有还原型辅酶I的消耗，在波长340nm处测NADH的吸光度下 降。
[0009] (5)原子分光光度法也可用于检测血清中钟、轴离子，但操作复杂，误差较大，不及 火焰光度法简便。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的是提供一种基于DNA酶检测钟离子浓度的方法。
[0011] 本发明所提供的基于DNA酶检测钟离子浓度的方法，包括下述：
[001引 （1)配制标准溶液DNA酶体系
[0013] 用含轴离子的缓冲液溶解可溶性钟盐配置多个浓度梯度的钟离子溶液，分别向每 个浓度梯度的钟离子溶液中加入DNA，得到多个DNA含量相同的钟离子-DNA体系；所述多 个DNA含量相同的钟离子-DNA体系反应后，得到多个构象不同的DNA G-四链体的体系，分 别向各个所述DNA G-四链体的体系中加入氯化血红素，得到氯化血红素含量相同的多个 DNA G-四链体-氯化血红素体系，所述多个DNA G-四链体-氯化血红素体系反应后，得到 多个标准溶液DNA酶体系；所述DNA为能够形成G-四链体的DNA ;
[0014] (2)配制待测溶液DNA酶体系
[0015] 将待测样品加入到所述含轴离子的缓冲液，得到待测样品溶液，向所述待测样品 溶液中加入所述DNA，得到待测样品-DNA体系，所述待测样品-DNA体系中所述DNA的含量 与所述多个DNA含量相同的钟离子-DNA体系中所述DNA的含量相同；所述待测样品-DNA体 系反应后，得到DNA G-四链体的体系，向该体系中加入氯化血红素，反应后，得到DNA G-四 链体-氯化血红素体系，所述DNA G-四链体-氯化血红素体系中的氯化血红素含量与所述 多个DNA G-四链体-氯化血红素体系中的氯化血红素含量相同；所述DNA G-四链体-氯 化血红素体系反应后，得到待测溶液DNA酶体系；
[0016] (3)标准溶液及待测溶液的配制
[0017] 将2, 2'-联氨-双（3-己基苯并喔哇晰-6-賴酸）二胺盐ABTS溶液与&〇2混 合，得到混合液，将该混合液称为底物溶液，向所述多个标准溶液DM酶体系中的每一个标 准溶液DNA酶体系中加入所述底物溶液进行反应，得到多个标准溶液样本；向所述待测溶 液DNA酶体系中加入所述底物溶液进行反应，得到待测溶液样本；
[001引 （4)标准曲线的制备
[0019] 测量所述多个标准溶液样本在420nm处的吸光度，绘制钟离子浓度与吸光强度值 的标准曲线；
[0020] (5)待测样本检测
[0021] 测量所述待测溶液样本在420nm处的吸光度，根据所述标准曲线，得到所述待测 样品中钟离子的浓度。
[0022] 上述方法所述（1)中，所述多个可为2个W上，如7个。
[0023] 上述方法所述（1)中，所述含轴离子的缓冲液通过下述至少一种缓冲液制备得 至IJ ;H轻甲基氨基甲焼-盐酸缓冲液、测酸-测砂缓冲液、H己醇胺缓冲液、咪哇-盐酸缓冲 液、双甘氨肤缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液、磯酸二氨轴-磯酸氨二轴缓冲液、巧 樣酸-巧樣酸轴缓冲液。
[0024] 所述含轴离子的缓冲液的抑值为6. 2-8. 2。
[00巧]所述轴离子来源于可溶性轴盐，如氯化轴、漠化轴、楓化轴和硝酸轴。
[0026] 所述可溶性钟盐的非限制性实例包括；氯化钟、硫酸钟、硝酸钟、漠化钟或楓化钟。
[0027] 上述方法所述（1)中，所述能够形成G-四链体的DNA选自下述 幸少 种；GGGCCAGGGAGCGGGGCGGAGGGGG (核巧酸序列如序列表中序列1所 示）、AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG (核巧酸序列如序列表中序列2所示）和 TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG(核巧酸序列如序列表中序列3所示）。
[0028] 上述方法所述（2)中，所述待测样品为人或动物的血液、尿液或其他体液。
[0029] 上述方法所述（3)中，所述混合液中的ABTS与&化的摩尔浓度比为0. 1?50,女口 0. 2?10,具体可为5. 8。
[0030] 所述标准溶液样本中的轴离子浓度可为大于0小于等于30mmol/l，如lOmmol/ L-25mmol/L，具体可为 10mmol/L、llmmol/L、13mmol/L、19mmol/L 或 23mmol/L。
[0031] 所述标准溶液样本中的DM分子的浓度可为0. 01?10ymol/L，如0. 1?2ymol/ L,具体可为 0. 1 y mol/L、0. 3 y mol/L、0. 7 y mol/L、0. 8 y mol/L、0. 45 y mol/L 或 1. 8 y mol/ L。
[0032] 所述标准溶液样本中氯化血红素的浓度可为0.01?lOymol/L，如0. 1? 2 y mol/L，具体可为 0. 2 y mol/L、0. 4 y mol/L 或 0. 48 y mol/Lo
[0033] 上述方法所述（1)、（2)和（3)中，所述反应的时间均为0. 1-3小时。
[0034] 上述方法所述（3)中，所述待测溶液样本中的轴离子浓度、DNA分子的浓度、和氯 化血红素的浓度分别与所述标准溶液样本中的轴离子浓度、DNA分子的浓度、和氯化血红素 的浓度相等。
[0035] 本发明的方法可W方便地用于检测各种溶液样品中的钟离子浓度，例如，可W检 测人或动物血液、尿液或其他体液中的钟离子浓度。
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