用于同时检测或定量多种目标物质的分析方法和分析试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于同时检测或定量多种目标物质的分析方法和分析试剂盒。
【背景技术】
[0002] 作为用于同时检测多个分析对象的技术，开发了 BIST (Beads array In Single Tip)(非专利文献1)。BIST是指，在圆筒状的芯片（以下称为"毛细管"）部分排列封 入有直径Imm的探针微珠的器件。所述探针微珠固定有与抗原、基因等测定对象物质 结合的抗体、抗原或者DNA片段等生物体分子。该BIST能够嵌合于Magtration装置 的喷嘴，因此能够使用与核酸提取相同的自动化装置（例如，Magtration(注册商标） System 6GC，Magtration (注册商标）System 12GC Plus (Precision system Science 公司 制））来进行杂交反应或抗原抗体反应和清洗操作。产生的信号可以利用扫描仪（例如， BISTnner(Precision system Science 公司制））进行检测。
[0003] BIST技术的最大特征在于，毛细管中配置有多个用于捕获不同目标物质的探针微 珠，能够实现多项目的同时检测。在应用到甲状腺刺激激素（TSH:thyroid stimulating hormone)、通过与其同时检验而临床上的有用性高的FT3 (Free Triiodo thyronine)、 FT4(Free thyroxine)的定量检验中，实用上所要求的检测浓度域涉及广范围（TSH: 0· 05-50uIu/mL，FT3 :0· 5-20pg/mL，FT4 :0· Ι-lOng/dL，以动态范围计为 IO3左右）。因此， 为了实现多项目同时检验，必须使来自各探针微珠的信号光（强度与目标物质的浓度成比 例地增加的光）局部化、并抑制与来自其他探针微珠的信号光的干渉。但是，至今为止，信 号光的局部化还不能说是充分达到的。
[0004] 现有技术文献
[0005] 非专利文献
[0006] 非专利文献1 :遺伝子多型簡易測定法CMC出版刊"月刊八彳才彳y夂只卜y - 2008年9月号"
【发明内容】
[0007] 发明要解决的课题
[0008] 为了同时检测或定量多种目标物质，本发明的目的在于使来自探针微珠的信号光 局部化。
[0009] 解决课题的方法
[0010] 本发明人经过广泛深入的努力，结果发现，通过在BIST中隔着滤光器来测定来自 探针微珠的发光，能够选择性地接受来自所需的探针微珠的发光，并完成了本发明。
[0011] 本发明的要旨如下所述。
[0012] (1) -种分析方法，其通过收容在单一容器内的、分别固定有用于捕获多种目标物 质的物质的多个载体发光，并从容器外部测定该发光，来同时检测或定量多种目标物质，其 中，通过隔着滤光器来测定源自载体的发光，由此选择性地接受源自所需的载体的发光。
[0013] (2)如⑴所述的方法，其中，滤光器设置于容器表面，或者容器本身为滤光器。
[0014] (3)如⑴或⑵所述的方法，其中，容器本身为滤光器。
[0015] (4)如⑴~⑶中任一项所述的方法，其中，使用测定对象的发光的波长区域中 的光线透射率为70 %以下的滤光器。
[0016] (5)如⑴~⑷中任一项所述的方法，其中，载体呈球状。
[0017] (6)如⑴~（5)中任一项所述的方法，其中，1维或2维地配置载体。
[0018] (7)如⑴~（6)中任一项所述的方法，其中，发光为化学发光或焚光，发光的波长 区域在340-900nm的范围内。
[0019] (8) -种分析试剂盒，其包括：分别固定有用于捕获多种目标物质的物质的多个 载体，和用于选择性地接受源自所需的载体的发光的滤光器，所述分析试剂盒用于通过收 容在单一容器内的、分别固定有用于捕获多种目标物质的物质的多个载体发光，并从容器 外部测定该发光，来同时检测或定量多种目标物质。
[0020] (9)如（8)所述的分析试剂盒，其中，容器本身为滤光器。
[0021] (10)如⑶或（9)所述的分析试剂盒，其中，发光为化学发光或焚光，发光的波长 区域在340-900nm的范围内。
[0022] 发明效果
[0023] 根据本发明，在同时检测或定量多种目标物质的体系中，能够使源自固定有用于 捕获目标物质的物质的探针微珠的信号光局部化，并抑制与源自其他探针微珠的信号光的 干渉。
[0024] 本说明书包括作为本申请优先权基础的日本专利申请日本特愿2012 - 232488的 说明书和/或附图中记载的内容。
【附图说明】
[0025] 图1示出BIST毛细管内构成。
[0026] 图2-1(左上）示出基于BIST的TSH(0. 5uIU/mL)测定中源自位于毛细管中央部 的探针微珠的发光峰。图2-2 (右上）示出基于BIST的TSH (25uIU/mL)测定中源自位于毛 细管中央部的探针微珠的发光峰。图2-3(下）示出毛细管材料的吸光度与信号光峰的值 的关系。
[0027] 图3-1 (左上）是以峰值将图2-2的数据归一化并用log尺度显示纵轴的图表。 图3-2 (右上）示出毛细管材料的吸光度与峰宽度（纵轴为1/3, 000的宽度）的关系。图 3-3 (下）示出毛细管材料的吸光度和峰值与峰宽度之比（P/W比）的关系（将Abs = 0. 0 时的P/W比设为1，以相对P/W比进行绘图）。
【具体实施方式】
[0028] 以下对本发明的实施方式进行更详细的说明。
[0029] 本发明提供一种分析方法，其通过收容在单一容器内的、分别固定有用于捕获多 种目标物质的物质的多个载体发光，并从容器外部测定该发光，来同时检测或定量多种目 标物质，其中，通过隔着滤光器来测定源自载体的发光，由此选择性地接受源自所需的载体 的发光。
[0030] 对于容器而言，只要能够从容器外部测定发光，则可以为任意容器，但适合具有透 光性，优选树脂、玻璃等透射光的材质。另外，容器的形状没有特别限制，可以为细管、移液 管状等形状。例如，在BIST的情况下，容器为能够进行收容在内部的液体的吸引、吐出的圆 筒状芯片。
[0031] 本发明的方法中，通过提高容器的透明度，能够降低信号光的扩散。容器的厚度 Imm的雾度值适合为20 %以下，优选为10 %以下，更优选为1 %以下。作为厚度Imm的雾度 值为20%以下的容器的材质，可例示：聚丙烯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、环 状聚烯烃、聚甲基戊烯等。
[0032] 雾度值为表示透明性的程度的值，JIS K7136中定义为扩散透射率与总光线透射 率之比。
[0033] 另外，发光或放射的波长区域中的容器的折射率适合为1.6以下，优选为1.55以 下，更优选为1. 50以下。作为折射率为1. 6以下的容器的材质，可以例示：聚丙烯、聚碳酸 酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、环状聚烯烃、聚甲基戊烯等。
[0034] 目标物质可以为血液、血清、尿、淋巴液、口腔内粘膜、指甲、喀痰等生物体试样、河 水、湖水、海水、土壌等试样中含有的作为分析对象的物质。作为目标物质，可以例示：核酸、 蛋白质、抗原、抗体、酶、糖等生物体物质，沙门氏菌、大肠杆菌等细菌类，钴、铁、钼、铜、锌、 神、锦、I凡等金属等。
[0035] 目标物质可以进行能够测定的标记，作为能够测定的标记，可以例示：荧光标记、 化学发光标记、电化学发光标记、酶标记、放射性标记、磁标记等。作为标记物质，可以例 示：海军蓝（Marine Blue)、级联蓝（Cascade Blue)、级联黄（Cascade Yellow)、焚光黄 (Fluorescein)、罗丹明（Rhodamine)、藻红蛋白（Phycoerythrin)、CyChrome、PerCP、德州 红（Texas Red)、别藻蓝蛋白（Allophycocyanin)、PharRed、俄勒闪绿（Oregon Green)_488、 Cy 系色素（例如Cy2、Cy3、Cy3. 5、Cy5、Cy7等）、Alexa系色素（例如，Alexa-488、Alexa_532、 Alexa-546、Alexa-633、Alexa-680、Alexa-700、Alexa-750 等）、BODIPY 系色素（例如， BODIPY FL、BODIPY TR-等）等荧光物质，鲁米诺（luminol)、吖啶、金刚烷基环二氧乙烷、 草酸酯、洛芬、光泽精、异氨基苯二酰肼衍生物等化学发光物质，三联吡啶-(4-甲基砜）NHS 醋钌（Π )络合物、二苯基蒽、四苯基蒽等电化学发光物质，P0D(Hydrogen peroxidase，过氧 化氢酶）、AP (alkaline phosphatase，碱性磷酸酶）、β半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖 氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶等酶等。另外，也可使用放射性同位元素（例如， 3H、14C、32P、 33P、35S、 125I等）等放射性物质等标记物质。
[0036] 目标物质可以被直接标记，也可以被间接标记。例如，后述的实施例中，使用了三 明治ELISA法。具体地，在固定于载体的一次抗体上结合作为抗原的目标物质后，使作为二 次抗体的生物素标记抗体与目标物质结合。然后，在该二次抗体上结合催化化学发光的链 霉素抗生物素蛋白化的HRP，标记目标物质。
[0037] 关于用于捕获目标物质的物质，只要为与目标物质结合的物质，则可以例示：抗 体、抗原、DNA片段、金属络合物、其他低分子化合物等，但并不限定于这些。
[0038] 载体可以为无定形粒子、球（微珠）、丝（线）、磁性微珠等任意形状，但优选为球 状。在载体采取球（微珠）或磁性微珠的形状的情况下，可以在各球（微珠）或磁性微珠上 固定用于捕获不同目标物质的物质。在载体采取丝的形状的情况下，可以在丝的各不同位 置处固定用于捕获不同目标物质的物质。在BIST的情况下，载体采取球（微珠）的形状。
[0039] 球（微珠）的大小为1mm左右，可以为塑料、陶瓷等材质的物体，这样的球（微珠） 记载于日本特开2000-346842号公报、日本特表平14-534657号公报等。
[0040] 磁性微珠的大小为几十μ m，可以通过使铁粉等与塑料、陶瓷等混合进行磁化而 成。这样的磁性微珠记载于日本特开平8-62224号公报（专利第3115501号说明书）、国际 公开W096/29602小册子、国际公开W097/44671小册子等。
[0041] 丝（线）的大小为直径0.1 mm左右，可以为树脂系的材质，这样的丝记载于日本特 开2006-214759号公报、国际公开W001/53831小册子、国际公开W02003/7901小册子等。
[0042] 载体适合1维或2维地配置。载体1维地配置是指，用于确定观测到的发光信号源 自哪个载体所需要的位置信息是1维的状态，例如，BIST中，可以说载体（微珠）是1维地 配置的。载体2维地配置是指，用于确定观测到的发光信号源自哪个载体所需要的位置信 息是2维的状态，例如，在板上以单层铺满载体的测定试剂盒可以说载体是2维地配置的。
[0043] 用于捕获目标物质的物质可以通过共价键、化学吸附、物理吸附、电相互作用