一种定量分析微量血干血滤纸片上视黄醇及其前体的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微量血干血滤纸片中视黄醇及其前体的分析检测方法。
【背景技术】
[0002] 血液中视黄醇均需从动植物食品中摄入，由其前体物质：β -胡萝卜素、视黄醇乙 酸酯和视黄醇棕榈酰酯在肠粘膜和肝细胞中转化形成，共同存在于血液中。只有综合视黄 醇及其前体的含量信息才能全面衡量体内视黄醇的水平。
[0003] 目前，普遍采用用焚光、紫外线分光光度法和高效液相色谱仪（High performance liquid chromatography，HPLC)定量分析血清或血衆中视黄醇，前两种方法萃取步骤繁琐， 结果受杂质影响大；而HPLC法可对血清中复杂组分进行分离，其检测敏感性与特异性相对 较高，但多数仅开发了检测视黄醇的方法，少有分析其多种前体的方法。
[0004] 此外，以上技术所需静脉血量均较大，约l_2ml，对于人群则必须抽取静脉血，对于 实验动物也须取静脉血，有的甚至需处死后取血，无论对于人群，还是对于动物，其依从性 均较差，且标本不便于远距离运送，这为分析人群和动物模型视黄醇及其前体水平，研宄其 生理病理功能带来较大困难。Whatman 903'?!纸片能稳定、均一、定量吸附血液，是一款通 过美国FDA验证通过的体外二级诊断用产品。通过采集微量血，吸附于Whatman 903~滤纸 片上，形成干血滤纸片，以便于标本的采集、保存和运输，也可弥补基层或部分缺乏高端检 测仪器及其操作人员的不足而不能分析视黄醇水平，同时已证实视黄醇可稳定存在干血滤 纸片中。因此，采集微量血制成干血滤纸片是广泛分析人群和动物模型视黄醇水平的理想 标本。然而，这种标本血液标本甚少（约10 μ L)，且在其中的含量甚微，而传统HPLC的灵敏 度相对低，不能分析。目前国际、国内仍缺乏分析利用干血滤纸片定量分析视黄醇及其前体 的方法。
[0005] 串联质谱（tandem mass spectrometry，MS/MS)仪具有高选择性、高灵敏度的优 势，是近年来飞速发展的技术，与HPLC对复杂样品的高分离浓缩、高通量能力的优点结合 起来，对微量生物样品多组分同步分析具有突出优势，为解决这一技术难题提供了可能。但 文献中对串联质谱中分析视黄醇及其前体的各项参数报道较少，且仪器厂家、型号的差异， 导致没有现成的检测参数可以采用，必须根据本研宄单位自己优化确定。此外，HPLC对视 黄醇及其前体的分离方法的报道也较少，且分析时间较长，约30min，不利于大样本分析。同 时，提取干血滤纸片视黄醇及其前体的方法尤为重要，是能有效检测的前提，它将影响整个 方法的灵敏度。但目前国际、国内仍缺乏分析从干血滤纸片中提取视黄醇及其前体的方法。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种定量分析微量血干血滤纸片中视黄醇及其前体的方 法。
[0007] 本发明的目的是通过以下措施实现的：
[0008] -种检测视黄醇及其前体的方法，包括以下步骤：
[0009] (1)从样品中萃取视黄醇和/或其前体；
[0010] (2) HPLC分离视黄醇和/或其前体；
[0011] (3)MS/MS 定量检测；
[0012] 所述样品是干血滤纸片标本，采用的萃取剂为三氯甲烷。
[0013] 上述萃取步骤包括蛋白变性步骤，采用试剂为含有0. 1 % BHT和0. 025mmol/L KOH 的甲醇。
[0014] 上述从样品中萃取视黄醇和/或其前体包括以下步骤：
[0015] ①血片溶解：将载有微量血的干血滤纸片用打孔器打出直径3. 2mm(即3. 2 μ 1的 全血）圆形滤纸血片，置于I. 5ml EP管中，加入100 μ 1含0. 1% BHT作为抗氧化剂的去离 子水，室温振摇，lOOOrpm，2min，充分溶解血液；
[0016] ②蛋白变性：取步骤①所得血斑标本，加入200 μ 1含有0. 1% BHT和0. 025mmol/ L KOH的甲醇变性沉淀蛋白质，漩涡震荡2min ;
[0017] ③萃取：以300 μ 1三氯甲烷作为萃取剂，取步骤②所得的所有溶液，在其中加入 萃取剂，室温振摇2min，离心13200rpm，8min ;
[0018] ④小心吸取含视黄醇、视黄醇乙酸酯、视黄醇棕榈酰酯、β -胡萝卜素的有机溶剂 层（底层）180 μ 1，氮气吹干。加入100 μ 1流动相充分溶解。HPLC-MS/MS上机检测。
[0019] 上述HPLC分离视黄醇和/或其前体步骤中，采用C8色谱柱，甲醇：CH2CL 2 = 95 : 5(v/v)为流动相，以0. 2ml/L等度流速，保持柱温20°C进行液相分离。
[0020] 上述MS/MS定量检测步骤中，以APCI离子源作为离子源，MRM质谱检测参数采用 表1所示。
[0021] 表1 MS/MS定量检测优化参数
[0022]
[0023] 上述MS/MS定量检测步骤中，MRM质谱检测参数的筛选包括以下步骤：
[0024] I.多反应检测模式（Multiple reaction model，MRM)离子对选择
[0025] 鉴定准分子离子：通过Analyst软件，开启装有化合物的针泵Syringe Pump (10 μ L/min)，注入单一标准品工作液（5 μ g/ml)，选择Ql Scan，Positive (正离子） 扫描，根据视黄醇及其前体分子量，输入质量扫描范围：视黄醇m/z 200-300,视黄醇乙酸 酯m/z 200-400,视黄醇棕榈酰酯m/z 250-550, β-胡萝卜素 m/z 200-550, d6-视黄醇棕 榈酰酯m/z 250-350,扫描时间2min，鉴定准分子离子，即母离子Ql的质荷比参数；
[0026] 观察到所有样品待测离子都出现在Ql Scan中，检查Ql信号的稳定性，以便于质 谱参数的优化。Q3扫描，即产物离子扫描模式确定离子强度最高的2-3个碎片离子Q3。
[0027] II. MRM质谱检测参数的优化
[0028] 监测化合物信号的稳定性以后，采用Ql SM扫描，输入准分子离子m/z，对其DP、 EP和CEP进行优化；具体方法是在Ramp Parameter Settings窗口下选择DP，点击Start 得到一个离子的电压曲线图，以DP值作为X轴，信号强度作为Y轴，取信号强度最高时对应 的DP作为其的优化值，记录每一个离子优化的DP值，回到Edit Ramp，重复此过程对EP和 CEP进行优化；
[0029] 用确定的Q1/Q3离子对来优化CE和CXP :选择MRM模式，输入观察到的Q1/Q3离子 对m/z，用优化的DP、EP和CEP的值，点击Edit Ramp钮，选择Collision Energy设定起始 值及终止值和步距：按Start或Acquire开始扫描，形成以CE值作为X轴，信号强度作为Y 轴，取信号强度最高时对应的CE作为这一碎片离子的CE优化值；先优化CE再重复此过程 优化CXP ;
[0030] 换用阴离子模式，比较阴、阳离子模式各化合物的离子强度，取强者为后续实验使 用的模式。
[0031] 本发明中，通过MultiQuant 2. 0. 2软件，以峰面积积分法对MS/MS定量检测数据 进行分析，计算峰面积，完成HPLC-MS/MS定量检测数据的收集；以d6-视黄醇棕榈酰酯为内 标，以普通标准品与内标的峰面积比为纵坐标，以二者浓度比为横坐标绘制标准曲线，构建 HPLC-MS/MS内标定量分析方法。
[0032] 有益效果
[0033] 1.本发明利用滤纸片（如Whatman 903?纸）作为载体吸附微量血，制成干血滤 纸片，克服了以往收集血清检测视黄醇时静脉血采集时取血多，人群依从性差，动物模型抽 血死亡，标本不方便远距离运送等困难。
[0034] 2.本发明将视黄醇及其各前体的特异分析与HPLC-MS/MS技术优化结合，提供了 分析视黄醇及其前体（β-胡萝卜素、视黄醇乙酸酯和视黄醇棕榈酰酯）质谱分析中分子离 子峰、碎片离子峰、解簇电压、碰撞能量、碰撞室入口电压和出口电压等参数，获得最佳MS/ MS分析条件；在色谱分析中，优化了固定相、流动相、柱温等色谱分离条件；计算所获得的 各物质峰面积确定了最适萃取方法，首次建立了从滤纸片上提取视黄醇及其前体（β -胡 萝卜素、视黄醇乙酸酯和视黄醇棕榈酰酯）的方法。
[0035] 3.本发明克服了现有分析方法灵敏度低，不能分析微量血视黄醇及其前体的困 难；本发明基质效应小、在标准曲线中的浓度范围内分析的线性关系良好、检出限较低、灵 敏度高、准确性好、精密度高，与HPLC方法检测血清视黄醇结果具有相关性，并同时同步分 析样品中视黄醇及其前体含量，为全面评估体内视黄醇水平提供了方法。
【附图说明】
[0036] 图1不同色谱柱分离色谱图；A-C8色谱柱分离色谱图，B-C18色谱柱采样图
[0037] 图2不同流动相下视黄醇及其前体的色谱图（Α :纯乙腈作为流动相所获色谱图； B :纯甲醇作为流动相所获色谱图；C :甲醇：二氯甲烷=95 : 5作为流动相所获色谱图；D : 甲醇：二氯甲烷=90 : 10作为流动相所获色谱图；E :