一种炙甘草提取物及其指纹图谱鉴别方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于中药质量分析技术领域，具体涉及一种炙甘草饮片提取物的制备，以 及采用高效液相色谱（HPLC)指纹图谱方法进行炙甘草饮片提取物质量鉴别和控制。
【背景技术】
[0002] 炙甘草，系豆科植物甘草、胀果甘草或光果甘草的干燥根及根茎，用蜜烘制而成。 炙甘草临床应用多为炙甘草汤，是以炙甘草为主要原料制成的汤，能够补脾和胃，益气复 脉。用于脾胃虚弱，倦怠乏力，心动悸，脉结代。目前炙甘草的质量控制方法采用的是甘草 的标准，由一些简单的鉴别方法发展到采用高效液相色谱方法测定其有效成分甘草苷及甘 草酸铵的含量，但是炙甘草因品种、产地的不同，其有效成分的含量存在一定的差异，仅凭 甘草苷和甘草酸铵两种成分的含量测定已明显不能满足于其质量控制，故用于临床的质量 稳定性也难以保证。
[0003] 中药指纹图谱技术是符合中医理论及现状的较好的质量控制技术，因为它并不需 要详细了解药物的具体活性成份信息，只需要了解个别指标性活性组分信息，以指标性成 份峰作为标记，结合非指标成份进行比对，用来综合评价药物质量，既符合中医药理论的整 体观点，也满足了对中药质量的可控、保证其疗效的要求。炙甘草作为一种常用药，多见于 对其汤剂的研宄，而对炙甘草提取物质量控制的研宄报道较少，本发明提出了一种炙甘草 提取物的指纹图谱鉴别方法，能够从整体把握炙甘草提取物的质量情况，为炙甘草提取物 的质量控制和真伪鉴别提供了一种有效的技术手段。
【发明内容】
[0004] 本发明目的是为提供一种炙甘草饮片提取物的制备方法，并通过HPLC指纹图谱 的方法对其进行质量鉴别和控制。
[0005] 制备炙甘草饮片提取物的方法，其包括以下步骤：取炙甘草饮片，加入饮片重量 6-12倍的水，一煎提取20-40分钟，二煎加炙甘草饮片重量4-10倍的水，提取10-30分钟， 滤液过滤、回收并浓缩，采用60°C减压真空干燥箱蒸干，即得。
[0006] 炙甘草饮片提取物制备方法中，水的用量是饮片重量的6-12倍，优选8倍。
[0007] 通过HPLC指纹图谱的方法鉴别和评价炙甘草饮片提取物，该方法包括如下步骤： A、取供测试的炙甘草饮片及提取物，所述供测试的炙甘草饮片提取物按权利要求1所 述方法处理得到炙甘草饮片提取物。
[0008] B、将炙甘草提取物粉碎，过四号筛，称取供试品粉末适量，置具塞锥形瓶中，加入 70%乙醇100ml，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，得到供试品，用于高效液相 色谱分析。
[0009] C、高效液相色谱条件为：色谱柱为C18色谱柱，流动相为乙腈-0. 05%磷酸，流速 为1.0 ml/min，检测波长为237nm，梯度洗脱方式如下： O到8min时，流动相A体积比为19% ; 8到35min时，流动相A体积比由19%上升到50% ; 35到36min时，流动相A体积比由50%上升到100% ; 36到40min时，流动相A体积比为100% ; 40到50min时，流动相A体积比由100%下降到19%。
[0010] D、精密吸取步骤B的供试品溶液，注入液相色谱中，按C所述的色谱条件进行洗 脱，得到供试品的HPLC图谱。
[0011] 其中C18色谱柱是Agilent TC-C18 (2)色谱柱；在一个实施方案中，所述Agilent TC-C18 (2)色谱柱规格为 4. 6mmX 250mm，5 μ m ;柱温 25°C。
[0012] 其方法学验证如下： 1. 仪器与材料 Agilent 1260高效液相色谱仪，二元泵，紫外检测器，真空脱气机，柱温箱，自动进样 器，美国Agilent公司产品，处理软件：Agilent化学工作站。
[0013] 色谱条件：色谱柱：Agilent TC-C18 (2)色谱柱（250mmX4. 6mm)，KQ-300DB 型数控 超声波清洗器，真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司）。
[0014] 炙甘草饮片，乙醇、磷酸(分析纯)，乙腈(色谱纯)。
[0015] 2.方法与结果 2. 1供试品溶液的制备 取炙甘草饮片，用紫砂锅进行标准煎煮，加入炙甘草饮片重量6-12倍的水，一煎提取 20-40分钟，二煎加炙甘草饮片重量4-10倍的水，提取10-30分钟；药液趁热过滤，合并两 次煎液，浓缩，60°C真空减压干燥箱蒸干，研细，过四号筛，即得炙甘草提取物粉末。称取炙 甘草提取物粉末0. 2g于具塞锥形瓶中，加入70 %乙醇100ml，超声处理30分钟，放冷，摇 匀，溶液用0. 45 μ m滤膜滤过，取续滤液，为供试品溶液。
[0016] 2. 2方法学考察 2. 2. 1精密度试验 取供试品溶液，在上述色谱条件下重复进样6次，直接观察各指纹图谱的整体情况，无 明显变化，重叠良好，共有峰相对保留时间的RSD小于1. 0%，相对峰面积的RSD小于2. 0%， 表明仪器精密度良好。
[0017] 2. 2. 2稳定性实验 取供试品溶液，在上述色谱条件下，分别在〇, 2, 4, 8, 12, 24h进样分析，直接观察各指 纹图谱的整体情况，无明显变化，重叠良好，共有峰相对保留时间的RSD小于3%，相对峰面 积RSD小于3%，表明样品在24h内稳定。
[0018] 2. 2. 3重复性试验 取样品6份，按2. 1要求分别制备供试品溶液，在上述色谱条件下进行分析，直接观察 各指纹图谱的整体情况，无明显变化，重叠良好，共有峰相对保留时间的RSD小于1%，相对 峰面积的RSD小于2%，表明方法重现性良好。
[0019] 2. 3指纹图谱的建立 取不同基源的炙甘草提取物样品，按2. 1要求制备供试品溶液，在上述色谱条件下进 行分析，得到炙甘草提取物的指纹图谱，见图2,并采用国家药典委员会开发的"中药色谱指 纹图谱相似度评价系统2004A版"软件对样品的指纹图谱进行了分析，以Sl为参照指纹图 谱进行相似度计算，炙甘草提取物相似度见表1 ;选择一个保留时间及峰形稳定的色谱峰 为参照物（S)，分别求出各样品中各组分相对参照物的相对保留时间，见表2, RSD小于1%。
[0020] 表1不同基源炙甘草提取物指纹图谱相似度表
表2不同基源炙甘草共有峰的相对保留时间
本发明建立的炙甘草提取物高效液相指纹图谱，其供试品制备方法简单，可操作性强， 色谱条件容易实现，控制方法完整，专属性强，精密度高，能从色谱整体特征面貌上把握炙 甘草提取物的质量情况，为炙甘草提取物的质量控制和真伪鉴别提供了一种有效的技术手 段。
【附图说明】
[0021] 图1炙甘草提取物的HPLC指纹图谱。
[0022] 图2不同基源炙甘草提取物HPLC指纹图谱比较，如图可见，不同产地的炙甘草饮 片提取物所得到的指纹图谱较稳定，重现性好，易于辨认，能从色谱整体特征面貌上把握炙 甘草提取物质量情况。 具体实施例
[0023] 1.炙甘草提取物的制备 取炙甘草饮片l〇〇g，一煎加入饮片重量8倍的水，提取30分钟，二煎加入饮片重量6倍 的水，提取20分钟；提取液回收并浓缩、采用60°C减压真空干燥箱蒸干，得到炙甘草饮片提 取物。
[0024] 2.仪器与材料 Agilent 1260高效液相色谱仪，二元泵，紫外检测器，真空脱气机，柱温箱，自动进样 器，美国Agilent公司产品，处理软件：Agilent化学工作站。
[0025] 色谱条件：色谱柱：Agilent TC-C18 (2)色谱柱（250mmX4. 6mm) ;KQ-300DB 型数 控超声波清洗器；真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司）；炙甘草饮片，乙醇、磷酸(分析 纯)，乙腈(色谱纯)。
[0026] 3.供试品溶液的制备 将炙甘草提取物研成细粉，过四号筛。称取炙甘草提取物粉末〇. 2g于具塞锥形瓶中， 加入70 %乙醇100mL，超声处理30分钟，放冷，摇匀，溶液用0. 45 μ m滤膜滤过，取续滤液， 作为供试品溶液。
[0027] 4.指纹图谱的制作 色谱柱为Agilent TC-C18 (2)柱，柱温25°C，流速为1.0 ml/min ;检测波长为237nm ; 流动相为乙腈-〇. 05%磷酸；梯度洗脱方式如下： O到8min时，流动相A体积比为19% ; 8到35min时，流动相A体积比由19%上升到50% ; 35到36min时，流动相A体积比由50%上升到100% ; 36到40min时，流动相A体积比为100% ; 40到50min时，流动相A体积比由100%下降到19%。
[0028] 在此条件下分析供试品溶液，得到炙甘草饮片提取物的指纹图谱，见图1。
【主权项】
1. 制备炙甘草饮片提取物的方法，具体包括如下步骤：取炙甘草饮片，加入炙甘草饮 片重量6-12倍的水，一煎提取20-40分钟，二煎加炙甘草饮片重量4-10倍的水，提取10-30 分钟，滤液过滤、回收并浓缩，采用60°C真空减压干燥箱蒸干，即得。2. -种炙甘草饮片提取物的指纹图谱鉴别方法，该方法包括如下步骤： A、 取供测试的炙甘草饮片提取物，研细，称取粉末0. 2-2g，置具塞锥形瓶中，加入70% 乙醇溶解，超声20-40分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，得到供试品； B、 高效液相色谱条件为：色谱柱为C18色谱柱，流动相为乙腈-0. 05%磷酸水溶液，流速 为I.Oml/min，检测波长为237nm，梯度洗脱方式如下： O到8min时，流动相A体积比为19% ; 8到35min时，流动相A体积比由19%上升到50% ; 35到36min时，流动相A体积比由50%上升到100% ; 36到40min时，流动相A体积比为100% ; 40到50min时，流动相A体积比由100%下降到19% ; C、 精密吸取步骤A的供试品溶液，注入液相色谱中，按B所述的色谱条件进行洗脱，得 到供试品的HPLC图谱。3. 根据权利要求2所述的方法，其B项中：所述C18色谱柱：AgilentTC-C18 (2)， 4. 6mmX250mm，5ym;柱温 25 °C。4. 如权利要求2所述指纹图谱中，其特征在于，获得8个共有特征峰，依次标记，选择相 对保留时间为测定值：0.225 (峰 1)、0.465 (峰 2)、0.483 (峰 3)、0.654 (峰 4)、0.678 (峰 5)、0.687 (峰6)、0.943 (峰7)、1(峰8)(5)。
【专利摘要】本发明提供了一种炙甘草提取物及其指纹图谱鉴别方法。制备炙甘草提取物的方法包括如下：取炙甘草饮片，两次煎煮提取，滤液过滤、浓缩、干燥，即得。采用Agilent 1260高效液相色谱仪，Agilent TC-C18（2）色谱柱，在检测波长为237nm的条件下进行梯度洗脱，得到炙甘草提取物指纹图谱。建立炙甘草提取物的特征图谱获得8个共有特征峰，如附图所示：标记8号峰为参照峰，相对保留时间作为测定值：0.225（峰1）、0.465（峰2）、0.483（峰3）、0.654（峰4）、0.678（峰5）、0.687（峰6）、0.943（峰7）、1（峰8）（S）。本发明所得的指纹图谱较稳定、重现性好、易于掌握，为炙甘草提取物的质量控制和真伪鉴别提供了一种有效的技术手段。
【IPC分类】G01N30/06, G01N30/02
【公开号】CN104914175
【申请号】CN201510230941
【发明人】张志强, 付静, 夏鑫, 高扬
【申请人】北京康仁堂药业有限公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年5月8日