甲醇：水=95 : 5作为流动相所获 色谱图；F :甲醇：水=90 : 10作为流动相所获色谱图
[0038] 图3不同流动相下视黄醇及其前体的离子强度
[0039] 图4柱温对视黄醇及其前体的分离度、离子强度的影响
[0040] 图5离子源对视黄醇及其前体的信号强度的影响
[0041] 图6去离子水对干血斑中视黄醇及其前体萃取效果的影响
[0042] 图7萃取试剂对视黄醇及其前体峰面积的影响
[0043] 图8变性试剂对视黄醇及其前体峰面积的影响
[0044] 图9视黄醇及其乙酸酯、棕榈酰酯、β -胡萝卜素标准曲线（A-视黄醇，B-视黄
[0045] 醇乙酸酯，C-棕榈酰酯，D- β -胡萝卜素）
[0046] 图10 HPLC-MS/MS与HPLC方法测定视黄醇结果的相关性
[0047] R :Retinol，RA :Retinyl acetate，RP :Retinyl palmitate，β -C : β -carotene d6-RA ：d6-Retinyl acetate。
【具体实施方式】
[0048] 实施例1
[0049] (一）材料和方法
[0050]
[0052] 试剂配制：视黄醇、视黄醇乙酸酯、视黄醇棕榈酰酯标准品溶解于含抗氧化剂3， 二叔丁基-4_ 羟基甲苯（Butylated hydroxytoluene，BHT)0. 1% (w/v)的甲醇溶液中， β-胡萝卜素标准品溶解于含BHT 0.1% (w/v)的二氯甲烷中，配制成浓度分别为5mg/ml， 2mg/ml，2mg/ml，5mg/ml的储存液，用含0. 1% (w/v)BHT的甲醇稀释1000倍后即为工作液， 工作液每周新鲜配制，避光，_20°C保存。
[0053] 稳定同位素标记的19，19，19,20,20,20-d6-视黄醇乙酸酯作为内标，用含 BHT0.1% (w/v)的甲醇溶解，O.lymol/L作为工作液浓度。
[0054] I. HPLC-MS/MS分析干血滤纸片中视黄醇及其前体方法的建立
[0055] I. 1干血滤纸片的制备
[0056] 人群标本采集：采集手指或足跟末梢血；
[0057] 动物标本采集：大白鼠：尾静脉刺破采血；小白鼠：尾末端剪破收集流出血液；
[0058] 将以上所采集血液滴注于Whatman 90318:滤纸片；血滤纸片避光、常温晾干后，立即 存放于-20°C冰箱保存。
[0059] I. 2MS/MS定性分析方法的构建及条件优化
[0060] ①多反应检测模式（Multiple reaction model，MRM)离子对选择
[0061] 鉴定准分子离子：通过Analyst软件，开启装有化合物的针泵Syringe Pump (10 μ L/min)，注入单一标准品工作液（5 μ g/ml)，选择Ql Scan，Positive (正离子） 扫描，根据视黄醇及其前体分子量，输入质量扫描范围：视黄醇m/z 200-300,视黄醇乙酸 酯m/z 200-400,视黄醇棕榈酰酯m/z 250-550, β-胡萝卜素 m/z 200-550, d6-视黄醇棕 榈酰酯m/z 250-350,扫描时间2min，鉴定准分子离子，即母离子Ql的质荷比参数。
[0062] 观察到所有样品待测离子都出现在Ql Scan中，检查Ql信号的稳定性，以便于质 谱参数的优化。Q3扫描，即产物离子扫描模式确定离子强度最高的2-3个碎片离子Q3。
[0063] ②MRM质谱检测参数的优化
[0064] 监测化合物信号的稳定性以后，采用QlSM扫描，输入准分子离子m/z，对其DP、EP 和CEP进行优化。具体方法是在Ramp Parameter Settings窗口下选择DP，点击Start得 到一个离子的电压曲线图，以DP值作为X轴，信号强度作为Y轴，取信号强度最高时对应的 DP作为其的优化值。记录每一个离子优化的DP值。回到Edit Ramp，重复此过程对EP和 CEP进行优化。
[0065] 用确定的Q1/Q3离子对来优化CE和CXP :选择MRM模式，输入观察到的Q1/Q3离 子对m/z，用优化的DP、EP和CEP的值，点击Edit Ramp钮，选择Collision Energy设定起 始值及终止值和步距：按Start或Acquire开始扫描，形成以CE值作为X轴，信号强度作为 Y轴，取信号强度最高时对应的CE作为这一碎片离子的CE优化值。先优化CE再重复此过 程优化CXP。
[0066] 换用阴离子模式，比较阴、阳离子模式个化合物的离子强度，取强者为后续实验使 用的模式。
[0067] I. 3HPLC-MS/MS定性、定量方法的建立
[0068] (1)HPLC-MS/MS定性方法的构建
[0069] ① MS/MS定性分析方法转化为液质连用的方法
[0070] ②色谱分析条件的建立与优化：
[0071] 根据视黄醇及其前体具有疏水性的化学性质，准备C18(XR-0DS II 75mmX2.0mm I. D.，3 μ m，Shimadzu，Kyoto，Japan)、C8 (Zobax C8 eclipse plusl50mmX2. 1 mm I. D, 3. 5 μm，Agilent，CA，USA)等色谱柱。平衡色谱柱，时间为5~10倍柱体积。以纯甲醇为 流动相，0. 2ml/min等度分离，扫描20min，观察各化合物色谱峰形及保留时间。取分离度 (resolution，R)大，且不小于1. 5,保留时间较短者为理想的色谱柱。
[0072] R = 2(tR2-tRl)/(ffl+W2)
[0073] tR :保留时间
[0074] W :峰宽=峰结束时间-峰起始时间
[0075] ii)流动相的优化
[0076] 流动相的组成
[0077] 由于视黄醇及其脂类在甲醇中溶解度较高，胡萝卜素易溶于二氯甲烷，微溶于 溶于甲醇，遂以甲醇与二氯甲烧（CH2CL2, HPLC级，Fisher Scientific)为初始流动相组成 进行调节，分别以甲醇：CH2CL = 90 : 10及95 : 5(v : V)、纯甲醇、甲醇：水=95 : 5 及90 : 10 (V : V)、纯乙腈为流动相，等度流速分离同一份标准品混合液中各化合物，比较 离子峰峰型、分离度、离子强度，选择视黄醇与其乙酸酯分离度大于1. 5、最后流出化合物保 留时间< 10min、峰型好、离子强度高的流动相及其组成。
[0078] 酸碱度对视黄醇及其前体检测的影响
[0079] 在以上优化的流动相中加入甲酸，使其终浓度为0.01%，调节流动相的酸碱度，以 便化合物的离解，在质谱检测中有更好的灵敏度，其余检测条件相同，比较加入前后视黄醇 及其前体的保留时间、离子强度及分离度。
[0080] iii)色谱柱温度的选择
[0081] 以上优化的流动相，流速0. 2ml/min，其余检测条件相同，考察色谱柱温度分别为 2〇°c、3〇°c、4(rc时视黄醇及其前体的检测情况，选择分离度及离子强度高的温度为后续实 验色谱柱温度。
[0082] ③离子源的选择
[0083] 调用以上质谱分析方法，使用上述HPLC优化的条件，先在ESI离子源的作用下分 析，然后换用大气压化学离子化（atmospheric chemical ionization，APCI)离子源，比较 相同浓度标准品的不同离子源作用下的离子强度，以高者确定随后使用的离子源。
[0084] (2)HPLC_MS/MS定量方法的建立
[0085] 通过MultiQuant 2. 0. 2软件，以峰面积积分法对各化合物及同位素标记标准品 进行分析，计算峰面积，完成HPLC-MS/MS定量检测数据的收集。
[0086] 以d6-视黄醇棕榈酰酯为内标，以普通标准品与内标的峰面积比为纵坐标，以二 者浓度比为横坐标绘制标准曲线，构建HPLC-MS/MS内标定量分析方法。
[0087] 1. 4视黄醇及其前体的萃取方法的优化
[0088] (1)血片溶解的研宄
[0089] 将干血滤纸片标本用标准打孔器打出直径3. 2mm (即3. 2 μ 1的全血）圆形滤纸血 片3个，置于1.5ml EP管中，加入100μΙ含0. 1 % BHT作为抗氧化剂的去离子水，室温振 摇，lOOOrpm，2min，充分溶解血液；同时与未加去离子水的方法进行比较获取血斑中视黄醇 及乙酸酯、棕榈酰酯、β-胡萝卜素的色谱峰面积。
[0090] (2)选择适当的蛋白变性试剂，确定最佳用量
[0091] 取3个直径3. 2mm血斑标本3份，分别加入200 μ 1不同试剂：乙腈、甲醇、乙醇，均 含0. 1 % BHT和0. 025mmol/L Κ0Η，变性、沉淀蛋白质，漩涡震荡2min，加入500 μ 1正丁醇漩 涡震荡2min，充分萃取视黄醇、视黄醇乙酸酯、视黄醇棕榈酰酯、β-胡萝卜素。比较获取血 斑中视黄醇及乙酸酯、棕榈酰酯、β-胡萝卜素的色谱峰面积。选择色谱峰面积大的蛋白变 性试剂为最