用于试样的具有发光体的结构的空间高分辨率成像的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于试样的具有发光体的结构的空间高分辨率成像的方法，其中，所述试样在测量区域中被加载以荧光激发光，所述荧光激发光将发光体从可激发的电子基态激发到被激发的发光态，其中，试样在测量区域中被加载以荧光退激发光的具有局部最小处的强度分布，所述荧光退激发光将发光体从被激发的发光态带回到所述可激发的电子基态，其中，记录从测量区域所发射的荧光，并且，所记录的荧光配属于局部最小处在试样中的位置。
[0002]在这样的方法中，由测量区域所发射的荧光的强度为局部最小处在试样中的位置上的发光体浓度的量度。通过对局部最小处的每个位置重复以上所提到的步骤地扫描具有局部最小处的试样来检测发光体在试样中的分布，并且因此描绘以发光体标记的结构。
[0003]在这里，用术语“发光体”是指这样的任意物质:当其处于被激发的发光态时，从该物质可获得作为测量信号的荧光。荧光染料尤其属于这样的物质。但是，以荧光的发射为基础的过程不必是荧光。也可以涉及散射、例如Raman散射，在所述散射中，从被激发的过渡状态发射散射光，所述被激发的过渡状态被看作被激发的发光态。
[0004]试样的让人感兴趣的结构可以本身具有发光体，即为自动发光的。然而，试样的让人感兴趣的结构也可以以发光体人工标记。以发光体对结构的人工标记例如可以通过所谓的抗体染色、即通过发光体通过免疫反应连接，或者通过基因技术的改变来进行，所述基因技术的改变导致发光体与让人感兴趣的结构的共同表达。
[0005]如果在这里谈到一种状态、例如发光体的可激发的电子基态或者被激发的发光态，则涉及发光体的能发光的最小单元即分子、复合物、缺陷处、量子点或者诸如此类的电子状态。
[0006]如果在这里谈到光、例如荧光退激发光的强度分布的局部最小处，则尤其是指强度分布的由干涉所产生的零位置。在此可能涉及真实的零位置，在该零位置中光的强度实际上返回到零，或者涉及一种这样的零位置:在该零位置中光的强度由于缺乏理想的光学情况而仅基本上返回到零。如果在这里谈到局部最小处的大小，则该大小尤其涉及体积的大小，在该体积中，相应的光造成通过该光追求的效果，例如通过该光激发的过渡，不达到饱和。
【背景技术】
[0007]一种用于试样的具有发光体的结构的空间高分辨率地成像的方法作为STED(受激辐射耗竭)网栅荧光显微镜已知，该方法包括独立权利要求1的前序部分的以上所说明的步骤。试样在测量区域中首先被加载以荧光激发光，所述荧光激发光将发光体从可激发的电子基态激发到被激发的发光态。然后，对试样在测量区域中加载以呈发射激励光形式的、具有局部最小处的荧光退激发光强度分布，所述发射激励光激励发光体发射具有发射激励光的波长、即具有与荧光的波长不同的波长的光，并且借此使其又退激发到其基态。当荧光退激发光使发光体从被激发的发光态在局部最小处之外各处通过受激发射又被退激发时，接着由测量区域所发射的荧光只可能来自荧光退激发光强度分布的局部最小处，因此能够对应于局部最小处在试样中的位置。
[0008]在以关键词STED已知的方法中，在试样的以发光体标记的结构的成像中实际上也达到非常高的具有高对比度的地点分辨率。然而在此，发光体显著地承受光化学负荷并且因此强烈地倾向于褪色。原因在于，荧光退激发光加载已经处于其被激发的发光态下的发光体，所述荧光退激发光为了约束其强度分布的呈零位置形式的局部最小处而必须以高的绝对强度施加。因此，除了所想要的使发光体返回其基态的被激励发射之外，其它的过程、尤其更大程度上的导致褪色的发光体电子激励也不是不可能的。也可能由于本来设置用于荧光退激发的光而出现由被激励的发射首先退激发的发光体的重新激发。
[0009]另一种用于试样的具有发光体的结构的空间高分辨率地成像的方法作为GSD(基态耗竭，Ground State Deplet1n)网栅焚光显微镜已知。在这种已知的方法中，发光体在被以焚光激发光加载之前被加载以焚光阻抑光，所述焚光阻抑光具有带有局部最小处的强度分布。荧光阻抑光使发光体转换为暗态、例如长寿命的三重态，从该暗态出来，发光体不被以荧光激发光激发到发光态。这种向暗态直至饱和的转换在荧光阻抑光的强度分布的局部最小处之外各处进行，即，在被加载以荧光阻抑光之后，发光体只在荧光阻抑光的强度分布的局部最小处中还处于其电子基态中，从该电子基态出发，发光体被以荧光激发光激发到发光态。因此，在以荧光激发光激发之后，由发光体发射的荧光来自荧光阻抑光的强度分布的局部最小处，因此能够对应局部最小处在试样中的位置。
[0010]在以关键词GSD已知的方法中，也存在发光体褪色的巨大风险，因为发光体在其被以荧光阻抑光所转换到的长寿命暗态中以提高的程度例如倾向于与氧气化学反应和/或承受这样的风险:发光体被荧光阻抑光或者荧光激发光进一步激发，从而发生发光体的光化学褪色。
[0011]另一种用于试样的具有发光体的结构的空间高分辨率地成像的方法作为 RES0LFT(可逆饱和焚光过渡 Reversible Saturable Optical FluorescenceTransit1ns)网栅荧光显微镜的变型已知，该RES0LFT网栅荧光显微镜使用所谓的可转换的发光体。所述发光体可借助于荧光阻抑光从其作为发光体起作用的第一构象状态转换到其不作为发光体起作用的第二构象形态，即，在第二构象状态中，发光体至少借助于在第一构象状态下适合于激发发光态的荧光激发光不能被激发到发光态，在所述发光态下发光体发射被作为测量信号记录的荧光。为了在荧光阻抑光的强度分布的局部最小处之外各处促使这种转换直至饱和，在第二构象状态寿命足够长的情况下仅需要相对小的光强度。此外不存在显著的这种风险:被转换到其另一构象状态的发光体从该另一构象状态出来脱色，因为发光体在该构象状态下对焚光阻抑光和焚光激发光不响应。
[0012]在具有可转换的发光体的RES0LFT网栅荧光显微镜的实际应用中，观测地点分辨率和对比度，该地点分辨率和对比度不如在STED网栅荧光显微镜中的地点分辨率不如对比度好。这能归因于，即使可转换的发光体被促使转换到其不能发光的构象状态直至饱和时，始终仍有显著份额的发光体还是处于其能发光的构象状态中。
【发明内容】
[0013]本发明的任务是，给出一种用于试样的具有发光体的结构的空间高分辨率地成像的方法，在该方法中达到STED网栅荧光显微镜的高地点分辨率和高对比度，然而，发光体比在STED网栅荧光显微镜的所有迄今已知的方法中承受更小的光化学褪色风险。
[0014]本发明的该任务通过具有独立权利要求1的特征的方法解决。在从属权利要求中限定根据本发明的方法的优选实施例。
[0015]在根据本发明的、用于试样的具有发光体的结构在空间上高分辨率地成像的方法中，执行所有对于STED网栅荧光显微镜方法来说具有代表性的步骤；即，根据本发明的方法涉及STED网栅荧光显微镜的特定方法:对试样在测量区域中以荧光激发光加载，所述荧光激发光将发光体从可激发的电子基态激发到被激发的发光态。此外，试样在测量区域中还被以荧光退激发光的具有局部最小处的强度分布加载，所述荧光退激发光将发光体从被激发的发光态带回可激发的电子基态而不发射荧光。记录从测量区域发射的荧光；将所记录的荧光对应于所述局部最小处在试样中的位置。
[0016]在根据本发明的方法中，在对试样在测量区域中以荧光激发光加载之前附加地以激发阻抑光的强度分布加载，所述激发阻抑光使发光体从可激发的电子基态转换到保护态。在保护态下，发光体受保护以免被荧光激发光和荧光退激发光电子激发。激发阻抑光的强度分布也具有局部最小处，该局部最小处与焚光退激发光的强度分布的局部最小处重置。
[0017]因此，根据本发明的方法也包括如在由可转换的发光体所用的RES0LFT网栅荧光显微镜方法中使用的那样的步骤。然而在根据本发明的方法中主要不是尝试:在提高地点分辨率的意义上，通过两个地点分辨地起作用的强度分布的、具有重合的零位置的强度分布的叠加来改进有效地起作用的点成像功能。而是在根据本发明的方法中主要充分利用:将发光体例如在具有可转换的发光体的RES0LFT方法中在激发阻抑光的强度