0037]根据图1(c)，对试样3在测量区域5中加载以荧光退激发光8，这次又是荧光退激发光8的强度分布的局部最小处9例外，它与根据图1 (a)的激发阻抑光4局部最小处6重叠。荧光退激发光8在其强度分布的局部最小处9之外各处使发光体I从其被激发的发光态转换回到其电子基态。在此，局部最小处9小于局部最小处6，S卩，在根据图1(c)的步骤之后发光体I在哪里还处于其发光态，取决于局部最小处9的位置。
[0038]如果接着根据图1(d)记录来自测量区域5的荧光10，则可将该荧光与根据图1 (C)的、荧光退激发光8的强度分布的局部最小处9的位置对应。
[0039]通过扫描具有测量区域5或者具有局部最小处9的试样来检测发光体I在试样3中的浓度分布并且因此也对试样中的结构2成像。为了能够实现这种扫描，发光体必须不仅能从其被激发的发光态、而且也能从其保护态快速地返回到其可激发的电子基态。如果就保护态而言不是这种情况，则可以在重复根据图1(a)至(d)的步骤之前在测量区域5的或者局部最小处9的最接近位置上对测量区域5中的发光体I加载以激发促进光，所述激发促进光使发光体从其保护态限定地返回到其可激发的电子基态。
[0040]图2在通过测量区域5的剖面中表示出荧光激发光7和荧光退激发光8的强度分布以及发光体I在被按照图1(a)加载以激发阻抑光4之后还处于其可激发的电子基态、即不处于其保护态的概率11。在根据图1(a)的局部最小处6之外各处，概率11仅具有小的值，该值几乎为零。即，只有在局部最小处6之内，发光体还处于其可激发的电子基态，而在局部最小处6之外各处，发光体以极高的概率处于其保护态。荧光激发光7和荧光退激发光8的强度分布在局部最小处6之外具有其共同的最大的强度。即，在发光体处于其保护态并且相应地不能被光化学褪色的地方，共同的最大的强度照射到发光体上。在概率11显著大于零的局部最小处6之内，除了荧光激发光7之外，只有荧光退激发光8的小的强度作用于发光体上，该小的强度不高于远在该强度的绝对最大值之下的值Imax。该小的强度虽然对于将发光体的发光的激发态STED典型地约束到局部最小处9上是足够的，但对于发光体的STED典型褪色是不够的，该STED典型褪色在荧光激发光7和荧光退激发光8的共同的绝对强度高的情况下出现。因此，在根据本发明的方法中，虽然达到了 STED方法的高的地点分辨率和高的对比度，但不必容忍通常与此关联的发光体褪色风险。
[0041]在这里所示出的激发阻抑光4和荧光退激发光8围绕局部最小处6，9的空间强度分布仅是示例性的。所述强度分布可以如在STED网栅荧光显微镜领域中已知的那样在任意空间方向上采用任意形状。
[0042]附图标记列表
[0043]I 发光体
[0044]2 结构
[0045]3 试样
[0046]4 激发阻抑光
[0047]5 测量区域
[0048]6 局部最小处
[0049]7 荧光激发光
[0050]8 荧光退激发光
[0051]9 局部最小处嫌寒 τ ^ 〔ia 來胳2〔la
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【主权项】
1.用于对试样(3)的具有发光体(I)的结构(2)进行空间高分辨率成像的方法， -其中，对所述试样(3)在测量区域(5)中加载以荧光激发光(7)，所述荧光激发光将所述发光体(I)从可激发的电子基态激发到被激发的发光态； -其中，对所述试样(3)在测量区域(5)中加载以荧光退激发光(8)的具有局部最小处(9)的强度分布，所述荧光退激发光将所述发光体(I)从所述被激发的发光态带回所述可激发的电子基态； -其中，记录从所述测量区域(5)所发射的荧光(10)，并且 -其中，将所记录的荧光(10)对应于所述局部最小处(9)在所述试样(3)中的位置，其特征在于，对所述试样(3)在所述测量区域(5)中在以所述荧光激发光(7)加载之前以激发阻抑光(4)的强度分布加载，所述激发阻抑光使所述发光体(I)从所述可激发的电子基态转换到保护态，在该保护态中，所述发光体(I)被保护以免被所述荧光激发光(7)和所述荧光退激发光(8)电子激发，其中，所述激发阻抑光(4)的所述强度分布也具有局部最小处(6)，该局部最小处与所述荧光退激发光(8)的所述强度分布的所述局部最小处(9)重叠。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光激发光(7)、所述荧光退激发光(8)和所述激发阻抑光(4)具有不同的波长。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光退激发光(8)和所述激发阻抑光(4)具有相同的波长。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述荧光退激发光(8)和所述激发阻抑光(4)被共同地施加到所述试样(3)上。5.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述荧光激发光(7)被脉冲式地施加到所述试样(3)上，并且，所述激发阻抑光(4)和所述荧光退激发光(8)相互独立地脉冲式地或者连续地也被施加到所述试样(3)上。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，带有时间分辨率地在所述荧光激发光(7)的每个脉冲之后记录所述荧光(10)。7.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述激发阻抑光(4)使所述发光体(I)借助于构象改变从所述可激发的电子基态转换到保护态。8.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述发光体(I)是能够借助所述激发阻抑光(4)关断的发光体(I)。9.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述发光体(I)是可转换的荧光蛋白。10.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述试样(3)在所述测量区域(5)中在被加载以所述激发阻抑光(4)之前被加载以激发促进光的强度分布，所述激发促进光使所述发光体(I)至少在所述荧光退激发光(8)的强度分布的所述局部最小处(9)的区域中转换到所述可激发的电子基态。11.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述激发阻抑光(4)这样干扰所述发光体(I)的可激发的电子基态以使其转换到所述保护态:使得所述发光体(I)在所述保护态中对于所述荧光激发光(7)具有至少按一个因子(2)减小的吸收横截面。12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述发光体(I)的所述电子基态通过运动脉冲和/或振动的传递来干扰。13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述运动脉冲和/或振动从以所述激发阻抑光(4)激发的调制器单元发出。14.根据权利要求11至13中任一项所述的方法，其特征在于，在所述被干扰的电子基态中，所述发光体(I)中的原子排列被干扰。15.根据权利要求11至14中任一项所述的方法，其特征在于，所述发光体(I)在所述被干扰的电子基态中不处于热平衡中。
【专利摘要】一种用于对试样(3)的具有发光体(1)的结构(2)进行空间高分辨率成像的方法，其中，对试样(3)在测量区域(5)中加载荧光激发光(7)，荧光激发光将发光体(1)从可激发的电子基态激发到被激发的发光态。并且对试样(3)在测量区域(5)中加载荧光退激发光(8)的具有局部最小处(9)的强度分布，荧光退激发光将发光体(1)从被激发的发光态带回可激发的电子基态。记录从测量区域(5)发射的荧光(10)并且将其对应于所述局部最小处(9)在试样(3)中的位置。在以荧光激发光(7)加载前，对试样(3)在测量区域(5)中加载激发阻抑光(4)的强度分布，激发阻抑光使发光体(1)从可激发的电子基态转换到保护态，在保护态，发光体(1)被保护以免被荧光激发光(7)和荧光退激发光(8)电子激发。激发阻抑光(4)的强度分布具有局部最小处(6)，其与荧光退激发光(8)的强度分布的局部最小处(9)重叠。
【IPC分类】G01N21/64
【公开号】CN104919303
【申请号】CN201480004263
【发明人】S·W·黑尔
【申请人】马克思-普朗克科学促进协会
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2014年1月9日
【公告号】DE102013100172A1, EP2943776A1, US20150308955, WO2014108455A1