一种用于四环素残留检测的丝网印刷电极适配体传感器制备
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于四环素残留检测的丝网印刷电极适配体传感器制备，属于农产品安全检测技术领域。
【背景技术】
[0002]近年来，随着我国畜牧养殖业的迅速发展，奶产量大幅度提高，新鲜牛奶和奶制品已经成为人民(尤其是老人和儿童)生活食品中的重要组成部分。抗生素被广泛用于预防及治疗奶牛疾病，由于频繁、超剂量使用，使得牛奶等动物源食品中存在一定量的抗生素残留。长期饮用或食用有抗生素残留的牛乳或乳制品，也就相当于长期低剂量的摄入抗生素，从而使人体肠道内的正常菌群受到抑制，导致致病菌大量繁殖引起全身或局部感染。由于奶牛乳腺炎发病率较高，用四环素来治疗乳腺炎等产科疾病仍较普遍，这容易导致在牛奶中四环素的残留。过量使用四环素类抗生素不可避免会使母体代谢产物等相关抗生素残留于动物的肌肉、蛋、奶、脏器组织中，进而通过食物链影响人体健康。牛奶中含有抗生素残留，不仅对人的健康造成很大的危害，而且对乳品加工企业带来重大经济损失。因此必须严格控制牛奶中抗生素残留，除了要做好科学饲养、精心管理、正确挤奶和预防疾病外，还要规范抗生素的使用。因此要避免上述情况的发生，除了从源头上控制抗生素的使用外，及时、准确地检测出动物源食品中的抗生素残留是保障畜产品安全的有效途径。可见，加强对牛奶等农产品中抗生素残留的检测，尤其是保障人类健康有着十分深远的意义。
[0003]传统的抗生素残留检测方法主要有:气相色谱(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、色谱/质谱联用技术(GC/LC-MS)、毛细管电泳法(CE)、荧光分析、酶联免疫法(ELISA)。这些方法虽然选择性好、灵敏度高、准确度高、检出限低，可同时检测多种元素或化合物，但其需要昂贵的仪器设备，样品前处理过程繁琐、费时，并且对分析人员的技术水平要求很高，不适于现场快速检测。核酸适配体(Aptamer)是人工合成的核酸序列，经多次筛选获得的核酸适配体与靶分子有很高的特异性和亲和力。而且适配体是由体外筛选和扩增获得的，不需要免疫动物或培养细胞，具有极好的准确性和重复性，很高的纯度，可以避免产生批间差异。另外，核酸适配体无免疫原性，可在不同温度、不同离子浓度、金属螯合剂存在条件下反复变性和复性，在合成过程中，各种报告分子(荧光素或生物素)和功能集团可精确地结合在适配体位点上。目前用抗体进行检测和诊断的技术几乎可以全部由适配体来代替。抗生素是小分子半抗原物质，难以制备相应的抗体，即使制备出相应的抗体，也存在免疫传感器的信号弱、重复使用性差、重现性不能满足实际样品检测的要求等问题。核酸适配体就可以很好的解决这个问题。与传统的分析方法相比，适配体具有如下特点:(I)较高的选择性，因此不需要对被测组分进行分离，即不用对样品进行预处理。(2)结构简单，体积小，使用方便，特别是便携式的免疫传感器，非常有利于农产品安全质量的快速测定。(3)可实现连续在线检测，使食品加工过程的质量控制变得简便。(4)响应速度快，样品用量少，与其他大型分析仪器相比，免疫传感器制作成本低，且可反复使用。
[0004]本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供了一种结构简单、操作方便、成本低且检测灵敏度高的丝网印刷电极适配体传感器制备方法。
【发明内容】
[0005]其技术方案为:一种用于四环素残留检测的丝网印刷电极适配体传感器制备，其特征在于:在由多壁碳-壳聚糖/纳米四氧化铁-壳聚糖修饰的丝网印刷电极表面，滴涂四环素适配体，制备四环素适配体传感器，将四环素适配体传感器用于牛奶中四环素残留的现场快速检测。
[0006]为实现以上功能，本发明的一种用于四环素残留检测的丝网印刷电极适配体传感器制备方法如下:(I)多壁碳-壳聚糖(MWCNTs-CHIT)复合物的制备:将ImL乙酸标准溶液添加到10mL水中制成1.0%乙酸。在盛有10mL 1.0%乙酸的烧杯中添加0.5g的壳聚糖，在室温下不断搅拌直至烧杯当中的壳聚糖完全溶解为止，得到壳聚糖溶液备用。再取1mL所得壳聚糖溶液，再将2.5mg的多壁碳溶于上述制备的0.lwt%的壳聚糖溶液中，在超声清洗仪中超声2h直至溶液呈现出均匀稳定的状态为止，即得多壁碳-壳聚糖(MWCNTs-CHIT)复合物；(2)纳米四氧化铁-壳聚糖复合物的制备:取1mL制备多壁碳-壳聚糖(MWCNTs-CHIT)复合物时所得壳聚糖溶液，再将2.5mg的纳米四氧化三铁溶于上述制备的0.1%的壳聚糖溶液中，不断搅拌至所得的溶液均匀稳定为止；(3)取15 μ L制备好的多壁碳-壳聚糖(MWCNTs-CHIT)复合物的制备滴涂在预处理好的丝网印刷电极表面，常温干燥，用pH7.5的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，氮气吹干；⑷电极表面瞭干后，取15 μ L纳米四氧化铁-壳聚糖(Fe3O4-CHIT)复合物滴涂在电极表面，常温下静置至干燥，然后用超纯水冲洗电极表面，氮气吹干；(5)然后将15yL 5mM的四环素适配体滴在上述经纳米材料修饰好的丝网印刷电极上，4h后用超纯水冲洗表面，晾干保存在4°C条件下备用。
[0007]所述的一种用于四环素残留检测的丝网印刷电极适配体传感器制备，其特征在于:丝网印刷电极的的清洗和活化，适配体传感器敏感界面的构建及过程表征(制备多壁碳-壳聚糖和纳米四氧化铁-壳聚糖复合物，利用多壁碳、壳聚糖和四氧化三铁的协同作用共同修饰丝网印刷电极)，适配体传感器工作曲线的建立，适配体传感器性能的检测，适配体传感器对实际样品的检测。
[0008]所述的一种用于四环素残留检测的丝网印刷电极适配体传感器制备，其特征在于:实验条件的优化，主要包括适配体浓度、测试底液的pH以及测试时间和温度；所制备的适配体传感器的工作曲线为:Δ I ( μ A) =1.0643LogC(M) +11.229 (R2=0.9651);适配体传感器性能检测包括重现性、稳定性、再生性、特异性以及适配体传感器对牛奶样品回收率的测定。
[0009]其制备原理为:适配体生物传感器以适配体作为识别元件，通过固定化技术将适配体结合到感受器表面，适配体与目标物结合后，形成的复合物与产生的物理或化学信号相关联，由换能器将其转化为与待测物质浓度(或活度)有关的可定量或者可处理的物理化学信号，再通过二次仪表放大并且输出信号，从而实现对待测物质的检测。本发明采用多壁碳-壳聚糖和纳米四氧化铁-壳聚糖复合物修饰电极。多壁碳-壳聚糖复合物作为修饰电极的第一层物质不仅可以作为分子导线加速电子在电子表面的传递。壳聚糖属于多糖类，它具有优异的成膜性、吸附性、透气性和渗透性，成膜后具有很好的吸附性、稳定性和良好的生物相容性，其丰富的氨基、多孔性结构使它被广泛用于生物分子的固定和修饰电极的制备。纳米四氧化铁的铁离子可促进电极与测试底液直接的电子传递，实现信号的二级放大。且壳聚糖很好的生物相容性，为适配体在电极表面的固定提供了一个良好的生物界面，保持了适配体的生物活性以用来和四环素进行有效的结合。采用本发明一种牛奶中四环素残留的适配体传感器制备及检测方法，可以在牛奶上市前，进行四环素残留的快速测定，直接对四环素残留量是否超标进行检测，避免因食用含有四环素的牛奶而引起四环素在人体内的蓄积造成严重的后果，为畜牧产品安全生产与消费提供残留检测的技术支撑。
[0010]本发明所用丝网印刷碳电极制作简单，具有能够实现批量生产、电极集成、样品用量小、成本低且一次使用可抛弃的优点，避免了共用同一电极检测多个样本时的交叉干扰问题，为生物传感器走向廉价、大规模应用提供了一种具有前景的途径，很好地解决了当前电极预处理的繁琐程序，且同批次电极具有很好的同一性，可以批量生产，实现商品化。
[0011]所述丝网印刷碳电极，包括印制电极的基片，印制于基片上的外部绝缘层和至少两根电极引线，基片印制有三个电极，分别为一个工作电极、一个对电极及一个参比电极，各电极对应连接有一电极引线。
[0012]所述清洗、活化丝网印刷碳电极，过程是:首先，将丝网印刷碳电极置于NaOH溶液中超声，超纯水冲洗，N2吹干，其次，将电极置于HCl溶液中超声，超纯水冲洗，N2吹干，再次，用无水乙醇冲洗电极，N2吹干，最后，在磷酸盐缓冲液中扫描电流-时间曲线，之后扫描循环伏安曲线直至性能稳定。
[0013]所述的一种用于四环素残留检测的丝网印刷电极适配体传感器制备，其特征在于:对裸丝网印刷电极以及以及MWCNTs-CHIT修饰的电极、MWCNTs-CHIT/Fe304_CHIT复合修饰电极，以及复合物修饰电极后固定适配体、适配体传感器结合四环素后的逐步修饰过程进行循环伏安(CV)表征。循环伏安测试是在-0.2-0.6V，扫速为0.05V/s的条件下进行，其测试底液为含 5mmol/L [Fe (CN) 6Γ/4_和 0.lmol/L KCl 的混合液的 0.lmol/L pH7.5 的磷酸盐缓冲溶液。通过交流阻抗方法(EIS)在室温下进行表征，可变电压为5mV，频率范围为0.1Hz-1OOkHzο四环素的残留浓度可通过适配体与四环素结合前后导致适配体传感器电流变化量(Δ I=I1- 12))进行测量，其中I1S适配体传感器与待测目标物反应前在测试底液中的电流，12代表修饰电极与待测目标物反应后在测试底液中的电流。
[0014]为达到以上目的，采取以下技术方案实现:一种用于四环素残留检测的丝网印刷电极适