一种用于溶解氧检测的产品及方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及溶解氧测定领域，特别涉及一种采用生物氧化酶测定溶解氧的试纸、 试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002] 水中的溶解氧是水生动植物生存的最基本条件，也是其它行业必须监控的重 要参数。溶解氧的测定在水产养殖、临床医学、环境保护、食品卫生等各个行业都具有 重要意义。以水产养殖为例，鱼类生活在水中，用鳃进行气体交换，故水中溶氧的多少 直接影响着鱼类的新陈代谢。当水中的溶氧量充足时，鱼摄食旺盛，消化率高，生长 快。当水中的溶氧量过少时，鱼的正常活动就会受到影响，严重缺氧时可引起鱼的死 亡。对于大部分鱼类来说，要求水中溶氧量不应低于4mg/L，低于2mg/L，就会产生轻 度浮头；当降至〇. 6-0. 8mg/L时，就会产生严重浮头；当降至0. 3mg/L以下时，鱼就会 开始死亡。目前测定溶解氧所用的方法包括碘量法（碘量法测定水中的溶解氧，国标 BG7489-87. ,Lide,DavidR. ,CRCHandbookofChemistryandPhysics87th,Boca Raton，Fl:CRCPress, 2006,ISBN0-8493-0487-3)、电极法（ClarkJr，LC;Wolf，R; Granger,D；Taylor,Z(1953).Journalofappliedphysiology,6 (3): 189 - 93., Severinghaus,Jff；Astrup,PB(1986).Journalofclinicalmonitoring, 2(2):125 - 39)、 分光光度法（Zollinger,H. ,ColorChemistry:Syntheses,propertiesandapplications oforganicdyeandpigments,ffiley-VCH, 2004. ,Goodfellow,G.I.Webber,H. M. ,Analyst, 1979, 104, 1105-1118)和焚光光学传感器（Hamlin,P.A. ,Lambert,J.L. ,Anal. Chem. , 1971, 63, 618-620. ,Wang,X.D. ,ffolfbeis, 0.S.Chem.Soc.Rev. 2014, 43, 3666-3761) 等。碘量法需要繁杂的滴定操作，非专业人员很难完成。其它三种方法要求与昂贵和复杂 的仪器相配套，不适合野外和非专业人员使用。本发明涉及一种水中的溶解氧的简便和快 速检测方法及产品，借助一种氧化酶及其相应的底物，通过氧化反应消耗水中的溶解氧，产 生等当量的过氧化氢，所产生的过氧化氢再把成色分子或基团氧化成有色产物，通过观察 产物的颜色变化或荧光变化，得出样品中的溶解氧含量。
【发明内容】
[0003] 本发明的一个目的是提供一种便携、效率高、灵敏度好的用于溶解氧检测的简便 快速的产品。
[0004] 本发明的另一个目的是提供一种简便、快速、准确率高的溶解氧检测方法及其在 水环境中溶解氧检测中的应用。
[0005] 为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] -种用于溶解氧测定的试纸，其特征在于：包括与氧气反应生成过氧化氢的氧化 酶及相应酶底物，以及与过氧化氢反应生成有颜色或带荧光的化合物的显色剂；其中，所述 氧化酶及相应酶底物，显色剂负载在载体上，制备成试纸。
[0007] 优选的，所述氧化酶及相应酶底物选自以下组中的一种或多种：葡萄糖氧化酶及 葡萄糖、乳酸氧化酶及乳酸、L-氨基酸氧化酶及L-氨基酸、D-氨基酸氧化酶及D-氨基酸、 L-a-羟基酸氧化酶及L-a-羟基酸、尿酸氧化酶及尿酸、醇类氧化酶及醇、醛类氧化酶及 醛等。更优选的，所述醇类氧化酶及醇包括但不限于：胆固醇氧化酶及胆固醇、乙醇氧化酶 及乙醇等；所述醛类氧化酶及醛包括但不限于：乙二醛氧化酶及乙二醛、视黄醛氧化酶及 视黄醛、牛醛氧化酶及牛醛等。
[0008] 优选的，所述显色剂为
车中&、R2、R3、R4、R5、R6、 R7、Rs独立的选自H、C「(：3的烷基、NH2，更优选的RpR2、R3、R4、R5、R6、R7、Rs独立的选自H、CH3、NH2，最优选的，显色剂为4, 4' -二氨基联苯，3, 5, 3'，5' -四甲基-4, 4' -二氨基联苯， 3, 4, 3'，4' -四氨基联苯，3'，3' -二甲基-4, 4' -二氨基联苯等；
[0009] 或者所述的显色剂为由4-氨基安替比林与
组成试剂对，其中 馬选自诎或順2，1?1。、1?11、1? 12、1?13、1?14独立的选自11、卤素、羧基、磺酸基、羟基和甲氧基。优 选的，所述M
为苯酚、苯胺、羧基苯酚、羧基苯胺。
[0010] 优选的，所述载体为纤维素及其衍生物纸张，例如实验室常规滤纸。
[0011] 优选的，所述载体上还负载催化剂和/或缓冲液；所述催化剂包括辣根过氧化物 酶、铁基化合物等能够催化过氧化氢与显色剂反应的物质；所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、 醋酸-醋酸盐缓冲液、PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液等。
[0012] 优选的，所述载体上氧化酶的负载量为0. 5-50U，更优选的，为3-20U。本领域技术 人员知晓，载体上氧化酶的负载量不限于上述具体数值，可以根据具体测量中测试瓶的体 积进行适当调整。
[0013] 优选的，所述试纸的制备方法如下：将氧化酶加入水中至全部溶解，得到溶液一； 将酶底物、显色剂加入水中至全部溶解，得到溶液二；向滤纸上滴加溶液一，室温晾干，得到 试纸一；另取滤纸，滴加溶液二，30°c~45°C下至滤纸烘干，得到试纸二。更优选的，烘干时 间小于12小时。
[0014] 本领域技术人员知晓，在制备试纸时，溶液一和/或溶液二中还可包括催化剂和/ 或缓冲液。
[0015] 本发明还提供一种用于溶解氧测定的比色卡，所述比色卡通过如下步骤制备：
[0016] (1)向盛有水的容器中分别通入不同氧气浓度的气体，持续通入气体直至水中溶 解氧浓度测量值稳定；
[0017] (2)取步骤（1)水样分别加入相同体积溶解氧测试瓶中，水样加满测试瓶，测试瓶 中无气泡，盖紧瓶盖，摇晃后静置2-5min，观察颜色变化；所述测试瓶内置有试纸；
[0018] (3)记录不同溶解氧浓度的水样颜色制作成溶解氧比色卡。
[0019] 具体的，可通过如下步骤制备：取8个200mL烧杯，加入自来水，向水中分别通入不 同氧气浓度的气体：纯氮气，2. 5 %氧气+97. 5 %氮气混合气体，5 %氧气+95 %氮气混合气 体，10%氧气+90%氮气混合气体，15%氧气+85%氮气混合气体，压缩空气（20. 8%氧气）， 35%氧气+65%氮气混合气体和氧气，持续通入气体10-30min;用仪器测试水中的溶解氧 浓度，直至测量值稳定；每个烧杯中取水样分别加入相同体积溶解氧测试瓶中，水样加满测 试瓶，测试瓶中无气泡，盖紧瓶盖，将瓶子上下翻转，摇晃，静置5分钟，观察颜色变化；所述 测试瓶内放置有负载氧化酶、相应酶底物及显色剂的试纸，所述氧化酶能够催化酶底物与 氧气反应生成过氧化氢；所述显色剂能与过氧化氢反应生成有颜色或带荧光的化合物；拍 摄5min时不同溶解氧浓度的水样，将照片制作成溶解氧比色卡。
[0020] 本领域技术人员知晓，上述容器的体积及个数、氧气浓度、静置及拍摄时间等的具 体参数仅用于示例性说明本发明溶解氧比色卡的制作方法，并不用于限定本发明。本领域 技术人员可以依据实际需求作适应性调整和改动。
[0021] 此外，本发明还提供一种用于溶解氧测定的试剂盒，包括氧化酶及相应酶底物，显 色剂；其中所述氧化酶能够催化酶底物与氧气反应生成过氧化氢；所述显色剂能与过氧化 氢反应生成有颜色或带荧光的化合物。
[0022] 优选的，所述氧化酶及相应酶底物选自以下组中的一种或多种：葡萄糖氧化酶及 葡萄糖、乳酸氧化酶及乳酸、L-氨基酸氧化酶及L-氨基酸、D-氨基酸氧化酶及D-氨基酸、 L-a-羟基酸氧化酶及L-a-羟基酸、尿酸氧化酶及尿酸、醇类氧化酶及醇、醛类氧化酶及 醛等。更优选的，所述醇类氧化酶及醇包括但不限于：胆固醇氧化酶及胆固醇、乙醇氧化酶 及乙醇等；所述醛类氧化酶及醛包括但不限于：乙二醛氧化酶及乙二醛、视黄醛氧化酶及 视黄醛、牛醛氧化酶及牛醛等。
[0023]优选的，所述显色剂，
其中&、R2、R3、R4、R5、R6、 R7、Rs独立的选自H、C「(：3的烷基、NH2，更优选的RpR2、R3、R4、R5、R6、R7、Rs独立的选自H、CH3、NH2，最优选的，显色剂为4, 4' -二氨基联苯，3, 5, 3'，5' -四甲基-4, 4' -二氨基联苯， 3, 4, 3'，4' -四氨基联苯，3'，3' -二甲基-4, 4' -二氨基联苯等；
[0024] 或者所述的显色剂为由4-氨基安替比林与
&成试剂对，其中 馬选自诎或順2，1?1。