通过直接maldi/ms检测干液斑中化合物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及存在于生物体液中至少一种化合物的检测方法，尤其涉及存在于干液 斑中至少一种化合物的检测和/或鉴定方法。本发明还涉及一种用于分析干液斑中化合物 空间分布的方法。本申请描述了用于干液斑分析的新方法。
【背景技术】
[0002] 液体分析目前主要在液态样本上进行。这样的液态样本不便于运输，而且分子化 合物的完整性不能长期保持。为了便于运输和更长时间的保存，液体可以在合适的载体上 进行干燥。例如，干血纸片法（或DBS)是最小血液取样技术，其包括滴加至少一个小血滴到 纸载体上。通常，该纸载体被特别设计为能够吸收小血滴以用于进一步分析。在送入分析 实验室之前，血斑允许在室温下风干几个小时。少量的血液样本和试样的易于处理造就了 DBS取样技术的成功。此外，它允许简化存储和廉价运输。它的成功始于20世纪60年代， 那时罗伯特?盖斯瑞（RobertGuthrie)博士开发出来了用于苯丙酮尿症检测的化验。从 那以后，"Guthrie卡"已在新生婴儿筛查中被全世界采用。利用纤维素载体血液取样（用 少量血液的微创技术）的优点是特别适合于儿科患者，但对于临床前及临床研究（3R原则： 减少，替代和优化）同样有吸引力。目前，干斑取样技术的使用被推广到其他生物体液，如 血清，血浆或尿液。
[0003] 例如，新生儿筛查和药理活性都采用质谱（或MS)技术用于干血斑分析。直到 最近，在液体介质中萃取和分离的几个步骤仍然是必要的；导致在MS分析可进行之前有 一个较长时间的样本制备。取自干血斑样本的少许（分析物）的液体萃取通常使用水溶 剂或有机溶剂的混合物进行，接着是液相色谱（LC)分离。由于液体萃取的步骤和/或分 离的步骤存在，样本被污染和/或存在于样本中的化合物被破坏可能在这些步骤当中的 一个步骤中发生。为了规避这些样本制备和操作的问题，而这在诊断和制药领域中极为 重要，新的、直接的技术发展起来了（综述见D6glonetal.，2012[AnalBioanalChem 2012,402:2485-2498])。技术的发展主要集中在通过直接洗脱（例如在线液体萃取）或 直接解吸/电离进行DBS快速分析。后一方法是最快的解决方案（无需预处理），特别适 合于高通量的干液斑分析。在这样的背景下，提出了一些从不同的基本电离技术发展而来 的敞开式MS方法：解吸电喷雾电离（DESI)和电喷雾电离（ESI)中的纸喷雾电离（PSI)，气 体放电电离（GDI)中的实时直接分析（DART)和电子电离（EI)中的常压热解吸化学电离 (APTDCI)〇
[0004] 这些MS方法用来分析不同的干液斑，但出现了主要的限制。例如，干血斑中的 分析物分布可能受到几种因素的影响，如血斑大小、红细胞压积水平和扩散性质（色层效 应）。通过直接解吸/电离的分析物化验，可能会被这些因素所影响。分析物分布成像是指 导这些分析物化验的有效方法。然而，干血斑中的分析物分布成像（在上述MS方法中）已 经完成。放射自显影的灵敏度和分辨率都还不足以进行可靠的分析。因此，由于成像方法 的低灵敏度和/或低分辨率，分析干液斑样本的直接解吸/电离方法会受到限制，从而导致 分析物检测不够精确。样品制备和随后的分析仍然是基本问题，其限制了这些方法在干液 斑分析领域的应用。
[0005] 因此，需要一种简单、快速且可靠但无需预处理的方法来检测存在于干液斑中的 化合物。此外，还需要一种不使用特定标签，允许存在于干液斑中化合物成像，同时具有高 灵敏度和高质量分辨率，而对生物污染物不太敏感的MS方法。
【发明内容】
[0006] 因此在这个背景下，本发明的目的是通过提供一种检测存在于液体样本中至少一 种化合物的方法，至少部分地解决目前现有技术中存在的问题，优选地，该方法没有液体萃 取步骤，最终通过印迹步骤，其可以保持存在于干液斑中化合物的空间分布，并允许通过分 子成像工具进一步测定它们的空间分布。
[0007] 根据本发明的一个方面，提供了一种检测存在于生物体液中至少一种化合物的方 法，所述方法包括以下步骤：
[0008] 步骤a，在载体上提供至少一个干液斑；
[0009] 步骤b，固定在所述载体上的所述干液斑的至少一部分到导电表面上；
[0010]步骤c，提供紫外光吸收化合物的水溶液或有机溶液；
[0011] 步骤d，将所述紫外光吸收化合物沉积到固定在所述导电表面上的所述载体上干 液斑的至少一部分上；
[0012] 步骤e，使载体上所述干液斑的至少一个区域经受基质辅助激光解吸/电离过程 以产生离子；
[0013] 步骤f，用质谱仪分析仪获取所述离子的全扫描模式质谱，和
[0014] 步骤g，通过分析所述全扫描模式质谱确定至少一种化合物的存在。
[0015] 该方法允许存在于干液斑中至少一种化合物快速且可靠的检测和可视化，而不需 要在通过MS分析之前的任何预处理步骤。本发明发明人发现通过MALDI质谱，载体上干液 斑的直接分析克服了现有技术的局限性。本发明申请人发现可以简单且快速地分析存在于 液体样本中的化合物，而不需要任何液体萃取和分离步骤，这是有利的，因为样品能够制备 得更快以及没有存在于干液斑中化合物的液体萃取步骤，避免了化合物潜在的污染和/或 降解。换句话说，本发明的方法不包括存在于干液斑中化合物的任何液体萃取和分离步骤。 至少一滴液体沉积在载体上后，载体上的干液斑至少一部分被固定在导电表面上，没有任 何干液斑的消解或液体萃取步骤。
[0016] 在另一实施例中，本发明涉及用于检测液体中至少一种化合物的方法，其中执行 了转移存在于干液斑中至少一种化合物到膜的进一步步骤。因此，在提供至少一个干液斑 到载体上后，所述方法包括以下步骤：
[0017] ?转移来自于干液斑的至少一种化合物到膜上，
[0018] ?固定所述膜的至少一部分到导电表面上。
[0019] 由于原始纸载体的厚度问题，通过MALDI质谱的干液斑直接分析可能承受某些应 用和/或化合物的挑战。所提出的间接方法可以通过转移至少一种化合物到较薄的载体上 解决这个问题，如纤维素或聚偏氟乙烯（PVDF)膜。此实施例可以克服厚度问题，而干液斑 上待分析的化合物的空间定位被保存在膜上。
[0020] 在一个优选实施例中，本发明涉及一种用于进一步测定干液斑内化合物空间分布 的方法，该方法包括进一步的步骤：
[0021] ?获得存在于干液斑内在至少2个区域离子的完整扫描模式质谱，相对于第二区 域，第一区域更靠近所述干液斑的中心，
[0022] ?对应于在所述干液斑区域内待检测的至少一种化合物计算出的质量电荷比，选 择精确质量电荷比（m/z)，
[0023] ?确定干液斑内所述化合物的空间分布。
[0024] 这种优选的实施例允许化合物的存在与其在干液斑内的空间分布相关联。这是有 利的，因为存在于干燥液斑中心和外围区域化合物的位置的显著差异可能会影响质谱（MS) 化验结果。化合物分布研究有助于指导和优化局部解吸/电离质谱的发展。此外，这种优 选的实施例允许干液斑中所选择的化合物的性质、浓度和空间位置相关联。
[0025] 优选地，使用根据本发明所述方法待分析的化合物是在液体中的化合物，其计算 出的质量电荷比在1〇〇到1500m/z之间。
[0026] 事实上，当化合物质量电荷比在100到1500m/z之间时，根据本发明所述的方法特 别有效。利用本发明所述的方法，基于测量的精确质量电荷比，这些化合物可以容易且快速 地在液体样本中被鉴定。
[0027] 本发明被独立权利要求所限定。从属权利要求限定有利的实施例。
【附图说明】
[0028] 下面通过参考附图以举例的方式更详细地解释本发明的上述和其他方面。附图 中：
[0029] 图1示出根据本发明的一个方面在干血斑上进行直接MALDI质谱实验的示意图。
[0030] 图2示出干血斑脂的MALDIFT-ICR质谱：（a) 57. 75-1500m/z区域的平均质谱； (b) 350-550m/z区域的放大视图；（c)550-750m/z区域的放大视图；（d)750-950m/z区域的 放大视图。质谱注释（1-35)对应于表1中的脂质分布。
[0031] 图3示出干血斑中两种小药物化合物的MALDIFT-ICR质谱：(a)示出右美沙芬 (500,100和20picomol/L) [M+H]+离子在248 - 287m/z区域的平均质谱；(b)示出胺碘酮 (500 和 100picomol/L) [M+H]+离子在 628 - 656m/z区域的平均质谱。
[0032] 图4示出在纤维素载体上的干血斑，转移了的PVDF膜和通过在膜上执行本发明所 述方法的质谱：(a)干血斑的光学图像；(b)用氨基黑IOB染色的转移了的膜的光学图像； (c) 200 - 1400m/z区