用于检测HBs抗原的样品的预处理方法及其利用
【专利说明】用于检测HBs抗原的样品的预处理方法及其利用 【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于检测作为B型肝炎病毒的表面抗原的HBs抗原的样品的预处理方 法及利用该方法的HBs抗原的检测方法。另外，本发明涉及用于检测HBs抗原的预处理用 试剂盒。 【【背景技术】】
[0002] B型肝炎是由B型肝炎病毒（HBV)引起的肝脏的疾病。HBV是主要由包膜部分及核 心部分构成的球状的病毒。在包膜部分存在HBs抗原，在核心部分存在基因组DNA、HBc抗 原及HBe抗原等。被HBV感染，则HBs抗原被释放到宿主的血液中，其量伴随肝炎的进行而 增加。所以，在B型肝炎的检查中，首先测定血液中的HBs抗原。检查的结果，当是HBs抗 原阳性时，显示受试者被HBV感染。相反，当是HBs抗原阴性时，显示受试者未被HBV感染。 另一方面，B型肝炎发症后，在宿主的体内产生作为HBs抗原的中和抗体的HBs抗体。通过 本B型肝炎的检查中也测定HBs抗体，可研究受试者的过去的感染的有无。在临床上，当是 HBs抗原阴性并且HBs抗体阳性时，被认为B型肝炎被治愈。
[0003] 但是，根据最近的研究得知，B型肝炎即使被治愈，HBV的基因之一部分残留在肝 脏或末梢单核细胞。于是，近年知，对于过去曾被HBV感染的恶性肿瘤患者或类风湿患者使 用治疗用免疫抑制剂时，HBV再活化而引起重症肝炎。那样的肝炎被称为"新生B型肝炎"， 与通常的B型肝炎比，显示剧症化的频度及死亡率高。
[0004] 在这样的新生B型肝炎的剧症化的预防中，认为发症的初期开始治疗是有效的。 为此，在其初期阶段发现病毒的再活化变得重要。但是，在再活化的初期阶段，认为不仅HBV 的病毒量尚是微量，也存在患者来源的HBs抗体。患者来源的HBs抗体与HBs抗原结合而 是妨碍该抗原的检测的要因，所以为了HBV的再活化的早期发现，需要非常高的灵敏度的 检查。
[0005] 作为HBV的检测灵敏度高的检查，已知利用PCR法的检查。在此检查中，通过将 HBV的DNA用PCR法扩增来检测HBV。但是，一般而言，此检查多是将待测样品送到可实施 该检查的机关而进行，所以至得到检查结果需要时间。另外，检查所耗的成本也高。
[0006] 另一方面，由免疫学方法的HBs抗原的检查与由PCR法的检查比，至得到检查结果 的时间短，另外成本也低。作为由那样的免疫学方法的HBs抗原的检测方法，例如，在专利 文献1中记载了通过使用碱剂或表面活性剂等的变性剂预处理样品，使患者来源的HBs抗 体变性之后，使用检测用的指定的抗HBs抗体检测HBs抗原的方法。
[0007] 【现有技术文献】
[0008] 【专利文献】
[0009] 专利文献1 :国际公开第2006/033368号 【
【发明内容】
】
[0010] 【发明要解决的技术课题】
[0011] 在由免疫学方法检测样品中的HBs抗原的方法中，受试者来源的HBs抗体成为HBs 抗原的检测的妨碍，所以有将其预先灭活的必要。例如，在专利文献1中记载的方法中记 载，为了使患者来源的HBs抗体变性，作为处理时的浓度，以0. 25~IN的氢氧化钠有效果。 另一方面，氢氧化钠也作用于HBs抗原而使变性，所以有该抗原的抗原性丧失，HBs抗原的 检测灵敏度降低的情况。
[0012] 如HBV的再活化的初期阶段一样，当不仅HBs抗原是微量，不得不从被认为也存在 受试者来源的HBs抗体的样品检测该抗原时，需求可不实质上损害HBs抗原的抗原性，使受 试者来源的HBs抗体变性而灭活，并且以高的灵敏度的HBs抗原的检测的方法。
[0013] 本发明，鉴于这样的情况，以提供可不实质上损害HBs抗原的抗原性，使受试者来 源的HBs抗体变性灭活，并且以高的灵敏度的HBs抗原的检测的样品的预处理方法及HBs抗原的检测方法作为目的。另外，本发明以提供可在那样的方法中适宜地使用的样品的预 处理用试剂盒作为目的。
[0014]【解决课题的技术方案】
[0015] 本发明人令人惊讶地发现，通过将含HBs抗原和受试者来源的HBs抗体的样品用 终浓度0. 012~0. 15N的极其低的浓度的碱性物质处理，可不实质上受受试者来源的HBs 抗体的影响，以高灵敏度检测HBs抗原，从而完成本发明。
[0016] S卩，本发明提供用于检测HBs抗原的样品的预处理方法，其包括：
[0017] 通过将疑似含HBs抗原的样品和含有碱性物质的预处理液混合至该碱性物质的 终浓度成〇.012~0. 15N而处理该样品的工序，
[0018] 将处理工序中得到的样品用含有酸性物质的试剂中和的工序。
[0019] 另外，本发明提供HBs抗原的检测方法，其包括：
[0020] 通过将疑似含HBs抗原的样品和含有碱性物质的预处理液混合至该碱性物质的 终浓度成〇. 012~0. 15N而处理该样品的工序，
[0021 ] 将处理工序中得到的样品用含有酸性物质的试剂中和的工序，
[0022] 向中和工序中得到的样品添加与HBs抗原结合的标记抗体、载体粒子、以及与HBs 抗原及该载体粒子结合的第1抗体，使在上述的载体粒子上形成含JBs抗原、该标记抗体及 该第1抗体的复合物的工序，
[0023] 选择性地回收形成工序中得到的样品中的载体粒子的工序，
[0024] 使回收工序中得到的载体粒子上的复合物游离，转移到与该载体粒子不同的固相 的工序，
[0025]测定转移工序中得到的固相上的复合物中含的标记抗体的标记的工序，
[0026] 基于测定工序的结果，检测疑似含上述的HBs抗原的样品中的HBs抗原的工序。
[0027] 再者，本发明提供用于检测HBs抗原的预处理用试剂盒，其含：含有碱性物质的第 1试剂，和含有对于中和碱性物质而言充分的量的酸性物质的第2试剂。
[0028]【发明效果】
[0029] 上述的本发明的样品的预处理方法及利用该方法的本发明的HBs抗原的检测方 法可不使样品中含的检测对象的HBs抗原实质上变性而灭活妨碍HBs抗原的检测的HBs抗 体。从而，由这些本发明的方法，即使HBs抗原是微量，且是也存在受试者来源的HBs抗体 的样品，也可以良好的灵敏度检测HBs抗原。另外，本发明的样品的预处理用试剂盒可在那 样的方法中适宜地使用。 【【附图说明】】
[0030] 【图1】是显示将HBV阳性患者的血清（HBV6290-6)在碱性物质的存在下预处理， 将该血清中的HBs抗原使用标记抗体检测时的结果（发光强度）的坐标图。
[0031]【图2】是显示将HBV阳性患者的血清（HBV11048-6)在碱性物质的存在下预处理， 将该血清中的HBs抗原使用标记抗体检测时的结果（发光强度）的坐标图。
[0032]【图3】是显示将HBV阳性患者的血清（HBV6272-6)在碱性物质的存在下预处理， 将该血清中的HBs抗原使用标记抗体检测时的结果（发光强度）的坐标图。
[0033]【实施方式】
[0034] 在本说明书中，"预处理"是指，在将疑似含HBs抗原的样品供于该抗原的检测方法 前，将该样品处理成对于检测适宜的状态。另外，本发明的样品的预处理方法，例如，可将以 下说明的"处理工序"和"中和工序"用手动方法进行，或者也可将"处理工序"用手动方法 进行，将"中和工序"用装置进行。
[0035] 在本发明的样品的预处理方法（以下也称为"预处理方法"）中，首先，通过将疑 似含HBs抗原的样品和含有碱性物质的预处理液混合至该碱性物质的终浓度成0. 012~ 0. 15N而进行处理该样品的工序（以下也称为"处理工序")。在此处理工序中，由预处理液 中含的碱性物质的作用，样品中的HBs抗体被变性而灭活。
[0036] 再有，处理工序中的碱性物质的终浓度只要在上述的范围内，就不特别限定，例 如，可举出 〇? 012、0. 013、0. 014、0. 015、0. 016、0. 017、0. 018、0. 019、0. 020、0. 030、0. 040、 0? 050、0. 060、0. 070、0. 080、0. 090、0. 10、0. 11、0. 12、0. 13、0. 14 及 0? 15N。
[0037] 疑似含HBs抗原的样品只要是活体样品或自该活体样品制备的样品，就不特别限 定。作为那样的活体样品，可举出组织、细胞、体液、分泌物及排泄物等。具体而言，可举出 全血、血浆、血清、淋巴液、骨髓液、胆汁、胃肠分泌物、精液、唾液、母乳、尿、粪便等。另外，作 为自活体样品制备的样品，可举出该活体样品的稀释液、悬浮液、提取液、匀浆物。例如，可 举出组织或细胞的提取液、或者组织或细胞的匀浆物。
[0038] 在本发明的实施方式中，预处理液中的碱性物质优选为现有技术中公知的强碱。 那样的强碱可从碱金属及碱土金属的氢氧化物、氢化物及酰胺化物选择至少1种。在它们 之中，特别优选为氢氧化钠、氢氧化钾及氢氧化镁。
[0039] 预处理液中的碱性物质的浓度只要是在混合该预处理液和疑似含上述的HBs抗 原的样品时，可使该碱性物质的终浓度成〇. 012~0. 15N的浓度，就不特别限定。从而，当样 品是液体时，预处理液中的碱性物质的浓度可根据该样品和预处理液的混合比（体积比） 适宜设定。例如，当将样品和预处理液以体积比表示1:1混合时，该预处理液中的碱性物质 的浓度设为〇. 024~0. 3N即可。在本发明的实施方式中，处于液体的形态的样品和预处理 液的混合比不特别限定，但优选为，以体积比表示1:1~1:0. 5。
[0040] 在本发明的实施方式中，为了由碱性物质的作用除去灭活的HBs抗体及/或其他 夹杂物，上述的预处理液优选为再含非离子性表面活性剂。那样的非离子性表面活性剂不 特别限定，但优选为选自公知的聚氧乙烯系非离子性表面活性剂。作为聚氧乙烯系非离 子性表面活性剂，例如，可举出聚氧乙烯烷基醚（Brij(注册商标）35、Brij(注册商标）45 等）、聚氧乙稀烷基苯基醚（Triton(注册商标）X-IOO、Triton(注册商标）X-114、NP-40 (注 册商标）等）、聚氧乙烯山梨坦脂肪酸酯（Tween(注册商标）-20、Tween(注册商标）-80等） 等，可使用它们之中的至少1种。在它们之中，也特别优选为聚氧乙烯烷基醚。
[0041] 预处理液中的非离子性表面活性剂的浓度不特别限定，但优选为是混合该预处理 液和样品时HBs抗原不实质上变性的浓度。例如，当预处理液含Brij(注册商标）35时，其 浓度只要是，混合该预处理液和样品时，Brij(注册商标）35的终浓度可成0. 05~0. 5%的 浓度即可。
[0042] 在本发明的实施方式中，为了由碱性物质的作用除去灭活的HBs抗体及/或其他 夹杂物，上述的预处理液优选为再含离液剂。其中，离液剂是指有不稳定化蛋白质的分子结 构的作用的物质。那样的离液剂不特别限定，例如，可举出尿素、胍盐酸盐、水杨酸钠、硫代 氰酸钠、过氯酸钠、乙酰胺、甲酰胺等，可使用它们之中的至少1种。在它们之中，也特别优 选为尿素。
[0043] 预处理液中的离液剂的浓度不特别限定，但优选为是混合该预处理液和样品时 HBs抗原不实质上变性的浓度。例如，当预处理液含尿素时，其浓度只要是，混合该预处理液