唾液葡萄糖监测系统的制作方法
【专利说明】唾液葡萄糖监测系统
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年1月11日提交的题目为"唾液葡萄糖监测系统"的美国临时 申请No. 61/751，451的优先权；以及要求2013年7月31日提交的题目为"唾液葡萄糖监 测系统"的美国临时申请No. 61/860, 519的优先权。所述两篇临时申请均以其整体援引加 入本文。
【背景技术】
[0003] 世界卫生组织（WHO)的统计学分析表明超过2. 2亿人伴有糖尿病生存（1)。糖尿 病在2005年引发一百一十万人死亡，而在2011年引发四百万人死亡。据估计显示2012年 有四百八十万人死于该疾病的并发症，其中低于60岁的人占死亡数的一半(www. cbsnews. com/8301-204 162-57549731/371-million-people-have-diabetes-Rlobally-about-hal f-undiaRnosed/)。早期诊断、及时治疗、以及持续控制对于确保患者的生活质量以及对于避 免由糖尿病引发的循环系统问题（如肾衰竭、心脏疾病和失明）而言是至关紧要的（1-2)。 目前控制糖尿病的做法依赖于监测血液葡萄糖。人们一般都不喜欢手指针刺所引起的疼痛 和不便，从而导致测试较少以及对血液葡萄糖的控制不足，这继而会导致该疾病的更多并 发症并且显著增加病例控制的花销。反复进行疼痛的手指针刺对于年幼的儿童而言是一个 很大的问题，并且对疾病死亡控制也有类似的不利影响。另外，手指针刺还会引起昏厥和血 源感染（3-5)。
[0004] 葡萄糖传感可以回溯到1841年检测尿液中的葡萄糖，但是已有显示表明尿液和 血浆葡萄糖之间的关联并不是始终一致的（6)。目前市场上有许多不同的葡萄糖计用于测 量血液葡萄糖。然而，要使用这些装置，患者每天需要多次针刺其手指以取血滴。也已经 开发了其它的技术，其使用最小侵入性或者无侵入性的技术来进行血液葡萄糖监测，包括 红外（IR)光谱（7-9)、荧光光谱（10-11)、拉曼光谱（12-13)、光学偏振旋转测量（14-17)、 光-声学探头（18)、表面等离子共振（19-20)。这些技术的结果受到波谱信噪比水平和样 品厚度的限制，并且需要与直接血液葡萄糖测量相结合。虽然也有基于光学测量的方法 (参见例如，http： //www. orsense. com/files/files/.Tournal of Diabetes Science and Technology, pdf所描述的OrSense NBM装置），但是由于所需装置的大小、成本、和操作的 复杂性等原因，大部分仅用于实验室用途且并不适宜于家庭常规葡萄糖监测。一种基于人 类汗液中葡萄糖检测的仪器已经市场化以用于糖尿病诊断。然而，由于汗液收集过程的复 杂性以及其准确性的水平使得其已经从市场上消失。另一种通过光学方法检测血液葡萄糖 浓度的产品称作〃闭塞光谱仪（occlusion spectroscopy) "(21)。然而，基于成本和操作简 易性的原因，仍然需要方便的、易于使用的、并且低成本的葡萄糖传感器。
[0005] 许多研究已经证明了血液葡萄糖和唾液葡萄糖水平之间存在关联（22-26)。直接 应用唾液葡萄糖测量来显示个体的健康状况在理论上是可行的并且看来可以实现。据报道 糖尿病患者的唾液葡萄糖水平要显著高于类似状况下无糖尿病的人（27-29)。因此，对唾 液葡萄糖水平的测量可用作糖尿病的另一种诊断方法以及用作正常或疑似患有糖尿病对 象的健康指示。有报道使用光学测量系统如液相色谱-质谱（LC-MS)或者紫外-可见光分 光光度计（22,24-26)来测量唾液中的葡萄糖。然而，仪器的成本很高并且其操作复杂且耗 时，使得其不适宜用于每天的个人使用。因此，这些方法不能用于家庭个体葡萄糖监测或者 在每天进行的疗程中使用。直至目前，并无适宜的技术用于使用唾液的家用葡萄糖测量，因 为并没有足够灵敏以检测唾液中低水平葡萄糖的易用、低成本的传感器系统。
[0006] 发明概述
[0007] 本发提供了适于使用电化学方法检测唾液样品中葡萄糖的高度灵敏的葡萄糖传 感器。所述唾液葡萄糖传感器适宜用于诊断糖尿病以及监测糖尿病患者或任何哺乳动物个 体的葡萄糖水平，其中仅使用少量的未经修饰的唾液，并且可以在几秒内获得结果。所述传 感器以可反复使用以及一次性使用的实施方式提供，并且其也可以整合至用于加工样品、 测量葡萄糖和/或其它分析物的流体系统，并且其结果可以在所述装置中进行分析和/或 转移至远距离分析、监测、或数据存储设施。
[0008] 本发明的一方面是用于确定液体样品中葡萄糖浓度的葡萄糖传感器。所述传感器 包括绝缘的或半导体基材，至少一个工作电极、反电极和参比电极，以及所述基材表面上的 用与在确定液体样品中葡萄糖浓度的过程中容纳所述液体样品的样品放置区。工作电极、 反电极和参比电极的每个均包括沉积于所述样品放置区中基材上的导电金属层。所述工作 电极任选在所述样品放置区涂覆有多个传感器元件。所述传感器元件（或者样品放置区 中的所述工作电极，如果不存在传感器元件的话）经含有葡萄糖氧化酶的涂层（coating) 功能化。所述工作电极、反电极和参比电极每个均连接至电流分析电路（amperometry circuit)，其输出电压提供了对置于样品放置区中的液体样品中葡萄糖浓度的量度。检测 电路的输出信号通过函数与液体样品中的葡萄糖浓度相关。例如所述输出信号可以与葡萄 糖浓度成比例，或者通过一些其它的函数与其相关，所述函数可使用一系列具有经校准葡 萄糖浓度的液体样品来确定。优选地，所述传感器或者一批传感器通过使用一系列不同葡 萄糖浓度所确定的校准曲线来校准。
[0009] 在所述葡萄糖传感器的实施方式中，所述基材包括选自以下组的材料：硅、玻璃、 陶瓷、不导电聚合物、及其组合。
[0010] 在所述葡萄糖传感器的实施方式中，所述工作电极包括选自以下组的一或多种材 料：金、铂、铱、银、银/氯化银、及其组合。
[0011] 在所述葡萄糖传感器的实施方式中，所述传感器元件（如果存在的话）包括选自 以下组的材料或者由选自以下组的材料组成：单壁碳纳米管（SWNT)、石墨、石墨烯、碳纳米 纤维、碳纳米线、及其组合。
[0012] 在所述葡萄糖传感器的实施方式中，所述传感器元件功能化涂层包括一或多层， 并且每层包括壳聚糖亚层、置于壳聚糖亚层上的金纳米颗粒亚层、和置于金纳米颗粒亚层 上的葡萄糖氧化酶亚层。
[0013] 在所述葡萄糖传感器的实施方式中，所述传感器还包括含有聚阳离子聚合物的 层；此层沉积于所述工作电极的表面上并且在所述传感器元件之下。在不同的实施方式中， 所述聚阳离子聚合物选自以下组：聚烯丙基胺、聚（L-赖氨酸）、聚乙烯亚胺、聚酰胺-胺树 状聚合物、及其组合。
[0014] 在所述葡萄糖传感器的实施方式中，所述传感器元件功能化涂层包含选自以下组 的一或多种材料：碳纳米管、石墨、金纳米颗粒、铂纳米颗粒、血清白蛋白、壳聚糖、以及普鲁 士蓝。
[0015] 在所述葡萄糖传感器的一些实施方式中，所述传感器包括传感器元件保护膜，其 覆盖所述电极以保护所述功能化涂层并限制所述涂层暴露于来自液体样品的污染。所述膜 包含以下或由以下组成：Nafion或脂质双层膜，或者另外类型的半透膜。
[0016] 在一些实施方式中，所述葡萄糖传感器是微流控装置的组件，该装置包括一或多 个将液体样品递送至所述传感器的样品放置区的通道。
[0017] 在所述葡萄糖传感器的实施方式中，所述传感器能够检测低至5ppm(0. 5mg/dL) 或更低浓度的葡萄糖。所述传感器的实施方式可被配置为用于确定唾液中的葡萄糖浓度， 也可以被配置为一次性装置或者可反复使用的装置。所述葡萄糖传感器的一些实施方式含 有一个或多个具有功能化传感器元件的工作电极，所述功能化传感器元件能够检测非葡萄 糖的分析物；此类实施方式可用于一或多种非葡萄糖的其它分析物的多元分析。
[0018] 本发明的另一方面是葡萄糖分析系统。所述系统包括上文所述的葡萄糖传感器以 及处理来自所述传感器的电信号的信号调节和/或分析装置。所述分析系统还可以包括发 射装置用以发送无线电信号至远距离接收器和/或数据处理装置。所述无线电信号带有与 液体样品中葡萄糖浓度相关的信息；所述信息得自所述信号调节和/或分析装置。所述分 析系统还可以包括记忆装置用于收集与液体样品中葡萄糖浓度相关的数据；所述数据可在 不同的时间获得或者得自不同的液体样品。所述分析系统还可以包括用于化学或物理学加 工液体样品并将加工过的样品递送至其样品放置区的装置。
[0019] 本发明的另一方面是确定液体样品中葡萄糖浓度的方法。所述方法包括以下步 骤：(a)提供上文所述的葡萄糖传感器、或者上文所述的葡萄糖分析系统；(b)将液体样品 引入所述传感器的样品放置区；和（C)从所述传感器的电输出确定液体样品中的葡萄糖浓 度。在所述方法的一些实施方式中，进行以下的额外步骤：（d)将步骤（b)中引入的液体样 品去除；（e)将新的液体样品引入到所述传感器的样品放置区；和（f)从所述传感器的电输 出确定所述新液体样品中的新葡萄糖浓度。在所述方法的实施方式中，所述液体样品来自 患有糖尿病或疑似患有糖尿病的对象。在所述方法的一些实施方式中，所述液体样品来自 进行作为健康筛查过程的一部分的测试的对象。在所述方法的实施方式中，所述液体样品 是唾液样品，如人类唾液样品。
[0020] 本发明的另一方面是制造葡萄糖传感器的方法。所述方法包括以下步骤：(a)在 绝缘基材的表面制造工作电极、参比电极和反电极，其中每个所述电极接触所述基材上的 样品放置区；(b)任选将聚阳离子聚合物层沉积于所述工作电极上；(C)任选将多个传感器 元件沉积于所述聚阳离子聚合物层上或者所述工作电极上；和（d)将多个功能化层沉积至 所述传感器元件上或所述工作电极上，所述功能化层包括壳聚糖亚层、金纳米颗粒亚层和 葡萄糖氧化酶亚层。在一些实施方式中，所述方法还包括以下步骤：（e)将传感器元件保护 膜沉积于所述传感器元件的功能化层上。所述保护膜可包括Nafion或脂质双层，或者由 Nafion或脂质双层组成。
[0021] 在所述方法的实施方式中，所述基材包括选自以下组的材料：硅、玻璃、陶瓷、不导 电聚合物、及其组合。在所述方法的实施方式中，所述工作电极含有选自以下组的一或多种 材料：金、铂、铱、银、银/氯化银、及其组合。在所述方法的实施方式中，所述传感器元件包 含选自以下组的材料：单壁碳纳米管（SWNT)、石墨、石墨烯、碳纳米纤维、碳纳米线、及其组 合。在所述方法的实施方式中，所述聚阳离子聚合物（如果存在的话）选自以下组：聚烯丙 基胺、聚（L-赖氨酸）、聚乙烯亚胺、聚酰胺-胺树状聚合物、及其组合。在所述方法的实施 方式中，一或多个所述功能化层含有选自以下组的材料：碳纳米管、石墨、金纳米颗粒、铂纳 米颗粒、血清白蛋白、壳聚糖、以及普鲁士蓝。在所述方法的实施方式中，所述传感器元件通 过自组装过程沉积至所述工作电极上，所述自组装过程包括将传感器元件的液体悬液沉积 至聚阳离子聚合物层上。在所述方法的实施方式中，所述方法包括将两个或更多个工作电 极沉积至所述基材上，每个具有经不同功能化的传感器元件。在一些实施方式中，所述经不 同功能化的传感器元件能够检测不同的分析物。在所述方法的实施方式中，一个或多个所 述电极被沉积从而使得其不与其它的电极共平面。相对于基材表面，每个电极可沉积于与 其它电极不同的层或者不同的水平（即，位于基材表面的平面、低于基材表面的平面、或在 基材表面的平面之上）。
[0022] 本发明的另一方面是葡萄糖传感器阵列，其包括共享同一基材的多个上文所述的 葡萄糖传感器。
[0023] 本发明的另一方面是葡萄糖传感功能化涂层。所述涂层可应用于电化学电池的电 极，以使得所述电极对于检测溶液中的葡萄糖是选择性的。所述涂层包括一或多层，每一层 含有壳聚糖亚层、置于壳聚糖亚层上的金纳米颗粒亚层、和置于所述壳聚糖亚层上的葡萄 糖氧化酶亚层。在实施方式中，所述葡萄糖传感功能化涂层还包括选自以下组的一或多种 材料：碳纳米管、石墨、金纳米颗粒、铂纳米颗粒、血清白蛋白、壳聚糖、以及普鲁士蓝。在所 述葡萄糖传感功能化涂层的实施方式中，所述涂层的最底层还包括壳聚糖亚层之下的传感 元件亚层。在实施方式中，所述传感器元件包括选自以下组的材料或者由选自以下组的材 料组成：单壁碳纳米管（SWNT)、石墨、石墨稀、碳纳米纤维、碳纳米线、及其组合。在实施方 式中，所述涂层还包括所述传感元件之下的阳离子聚合物层。聚阳离子聚合物可以选自以 下组：聚烯丙基胺、聚（L-赖氨酸）、聚乙烯亚胺、聚酰胺-胺树状聚合物、及其组合。
[0024] 本发明的另一方面是葡萄糖传感电极，其含有涂覆有上文所述葡萄糖传感功能化 涂层的金属或导电材料。
[0025] 附图简述
[0026] 图IA显示了本发明唾液葡萄糖传感器实施方式的样品施加区的图片。长方形表 示存放唾液滴的样品区。所述样品