一种红毛走马胎药材或其提取物的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药技术领域，设及一种中药中活性成分的检测方法，具体来说，是设 及红毛走马胎药材或其提取物中百两金皂巧B的HPLC-ELSD检测方法。
【背景技术】
[0002] 红毛走马胎为紫金牛科紫金牛属植物虎舌红ArdisiamamillataHance的干燥全 草，既是著名的观赏植物，又是我国民间常用草药，具有清热利湿、平肝解郁、活血化渺的功 效，其药用价值早在《本草纲目》中就有记载，对治疗肝炎、风湿、小儿巧积等有奇效。现代药 理研究表明本品具有良好的抗肿瘤活性，其主要有效成分是百两金皂巧B(ardisiacrispin B)，该成分存在于同属朱砂根、百两金等多种植物中，其化学名称为西克拉敏A3-0-Q-鼠 李化喃糖-(1 一 2)-P-D-葡萄化喃糖-(1 一 4)-[P-D-葡萄化喃糖-(1 一 2)-]-a寸-阿 拉伯化喃糖巧。
[0003]目前对该属植物的研究热点主要集中在化学成分和抗肿瘤等活性方面，尚未见百 两金皂巧B的定量分析方法，为深入探讨红毛走马胎的提取工艺、成药性及药理活性，从该 药材中提取分离得到百两金皂巧B单体，并按照对照品研究技术指导原则进行了纯化及结 构鉴定。本发明采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法（HPLC-ELSD)建立起红毛走马胎中 百两金皂巧B的定量分析方法，并对不同产地来源的药材样本及提取物进行了测定，为红 毛走马胎及同属含百两金皂巧B药材的深入研究和新药开发提供新的分析手段和参考数 据。
【发明内容】
[0004] 本发明设及一种使用HPLC-ELSD法测定红毛走马胎药材或其提取物中百两金皂 巧B含量的检测方法，其步骤包括：色谱条件与系统适用性试验、对照品溶液的制备、供试 品溶液的制备、百两金皂巧B含量测定；其中百两金皂巧B含量测定的方法为：分别精密吸 取百两金皂巧B对照品溶液5yL、20yL;红毛走马胎供试品溶液5~10yL;注入液相色谱 仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得。
[0005] 根据前述的检测方法，其中，所述色谱条件与系统适用性试验是用十八烷基硅烷 键合硅胶为填充剂；体积比为60 : 40~70 : 30的甲醇-水为流动相；蒸发光散射检测器 检测；理论板数按百两金皂巧B计算不得低于5000。
[0006] 根据前述的检测方法，其中，所述对照品溶液的制备采用如下方法：取百两金皂巧 B对照品适量，精密称定，加40 %~80 %的甲醇或乙醇制成每1ml含0. 05~0. 15mg的百两 金皂巧B对照品溶液，即得。
[0007] 根据前述的检测方法，其中，所述百两金皂巧B对照品采用如下方法自制：将红 毛走马胎粉碎，用50 %~80%的乙醇提取，将提取液减压浓缩，上大孔吸附树脂，用水和 30%乙醇冲洗除杂，再用80%乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩干燥，上硅胶柱层析，W体积比为 70 : 30的乙酸乙醋-甲醇洗脱，合并富含百两金皂巧B的流份，除去溶剂，甲醇重结晶，审U 备型高效液相色谱分离纯化，色谱条件：Cis柱；流动相：体积比为60 : 40~70 : 30的甲 醇-水；检测波长：205nm，收集目标峰流出液，浓缩、干燥、即得。
[0008] 根据前述的检测方法，其中，所述供试品溶液的制备采用W下方法：取红毛走马胎 药材粉末（过=号筛）0. 1~0. 2g，精密称定，置具塞锥型瓶中，精密加入50~70 %的乙醇 或甲醇25~lOOmU密塞，称定重量，超声处理50minW上，取出，放冷，再称定重量，用相同 溶剂补足减失的重量，摇匀，过滤或离屯、，取续滤液或上清液，即得。
[0009] 根据前述的检测方法，其中，所述超声处理指超声功率200~400W，频率30~ 50 曲Z。
[0010] 根据前述的检测方法，其中，所述采用HPLC-ELSD法测定百两金皂巧B含量包括如 下步骤及优化条件：
[0011] 照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录VID)测定；
[0012] 色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；体积比为 65 : 35的甲醇-水为流动相；蒸发光散射检测器检测，理论板数按百两金皂巧B计算不得 低于5000 ;
[0013] 对照品溶液制备取百两金皂巧B对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1ml含 0.Img的百两金皂巧B对照品溶液，即得；
[0014] 供试品溶液制备取红毛走马胎药材粉末（过=号筛）0. 15g，精密称定，置具塞锥 型瓶中，精密加入50%乙醇50血，密塞，称定重量，超声（功率300W，频率40曲Z)处理60分 钟，放冷，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀，离屯、，取上清液，即得；
[0015] 测定方法分别精密吸取对照品溶液5y^ 20yL;供试品溶液5~10yL;注入液 相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得。
[0016] 本发明所提供的红毛走马胎药材或其提取物中百两金皂巧B含量的HPLC-ELSD检 测方法具有如下优点：
[0017] (1)本发明提供的方法首次引入了红毛走马胎药材或其提取物中有效成分百两金 皂巧B的含量测定，从而使红毛走马胎的质量控制方法更加可靠；
[0018] (2)本发明所提供的的红毛走马胎药材或其提取物的分析方法首次将HPLC-ELSD 法用于红毛走马胎药材或其提取物中活性成分百两金皂巧B的含量测定，具有良好的线性 关系、精密度、重复性、稳定性、耐受性和回收率，测定简便快速。
【附图说明】
[0019] 图1为百两金皂巧B对照品溶液的HPLC-ELSD色谱图；
[0020] 图2为红毛走马胎药材的HPLC-ELSD色谱图；
【具体实施方式】
[0021] 1仪器、试药与样品
[0022] (3)高效液相色谱仪（美国安捷伦1100系列），包括在线真空脱气机（G1322A)， 四元梯度累（G1311A)，自动进样器（G1313A)，柱溫箱（G1316A)，DAD检测器（G1314A)， 化emstation色谱工作站；AlltechELSD2000型蒸发光散射检测器；制备型高效液相色谱 仪（美国贝克曼库尔特邸CHMAN125P型），包含SYSTEMGOLD125PSolventModule和16化 Detector等；Milli-Q超纯水器（美国Milipore公司）；Mic;rofuge18台式离屯、机（美国贝 克曼库尔特有限公司）；KQ-500DE超声清洗机（昆山市超声仪器有限公司，功率300W，频率 40曲Z) ;BP-210D型电子分析天平（德国赛多利斯，十万分之一）；过滤装置（Autoscience) 及微孔滤膜化 45ym)。分析色谱柱：WatersSymmet;ryQs(150mmX4. 5mm，5ym); PhenomenexGemini(ISOmmX4. 5mm, 5ym)；AlltechAltimma(250mmX4. 5mm， 5ym);制备色谱柱：邸OMANULTRAPREPC18 但 1.lmmX150mm，10ym);保护巧：pheno皿ex 〔18。
[0023] 百两金皂巧B自制（烙点：263-265°C，薄层色谱多个展开及显色系统均显示一个 斑点，采用HPLC-ELSD峰面积归一化法计算其质量浓度大于98%，符合定量分析用中药化 学对照品的纯度要求）；甲醇、乙腊为色谱纯，水为高纯水；其余试剂均为分析纯。红毛走马 胎采自四川省不同地区，经张文锦、黄静教授鉴定为虎舌红ArdisiamamillataHance的全 草；部分药材样品购买于中药材市场或饮片公司，药材来源见表2。
[0024] 2对照品制备
[00巧]将红毛走马胎粉碎，用50 %~80 %的乙醇提取，将提取液减压浓缩，上大孔吸 附树脂，用水和30 %乙醇冲洗除杂，再用80 %乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩干燥，上硅胶柱 层析，W体积比为70 : 30的乙酸乙醋-甲醇洗脱，合并富含百两金皂巧B的流份，除去 溶剂，甲醇重结晶，用制备型高效液相色谱分离纯化，色谱条件：Cis柱；流动相：体积比为 60 : 40~70 : 30的甲醇-水；检测波长：205皿，收集目标峰流出液，浓缩、干燥，即得。
[0026] 将制得的百两金皂巧B对照品采用高分辨质谱（HR-FAB-M巧给出精确分子量： m/zl097. 5432[M+Na]，对应分子式为：Cs化6〇22化（分子量计算值为：1097. 5509);其碳、 氨核磁共振信号根据gCOSY，HMQC，HMBC所显示的相关关系得到了归属，结构鉴定为西 克拉敏A3-0-Q-鼠李化喃糖-(1 一 2)-P-D-葡萄化喃糖-(1 一 4)-[P-D-葡萄化喃 糖-(1 一 2)-]-a 阿拉伯化喃糖巧。
[0027] 本发明制备的虎舌红素B经高效液相色谱-蒸发光散射检测法（HPLC-ELSD)纯度 检查，不同色谱柱和流动相测定结果均为一个色谱峰，WHPLC-ELSD峰面积归一化法测定， 其质量分数均大于98%，符合含量测定用中药化学对照品的要求。
[002引 3方法优化
[0029] 3. 1蒸发光散射检测器参数优化
[0030] 其主要参数有漂移管溫度和气体流速，W5°c为递增值，考察漂移管溫度在 70°C~120°C条件下同一供试品溶液百两金皂巧B的峰高和噪声情况，结果显示漂移管 溫度为95°C时，其信噪比较佳。另一方面，W步长0.化?min1，考察了气体流速从1. 2~ 2. 4L?min1时对响应值和噪声的影响，结果发现气体流速降低，其响应值增高，但噪声也随 之增加，其信噪比在2.化?min1时较佳。
[0031