] 3. 2提取方法与溶剂优化
[0032] 供试品溶液提取方法比较了回流与超声的提取效果，结果差异不大，故确定为更 简便的超声提取法。提取溶剂考察了水、30 %甲醇、50 %甲醇、70 %甲醇、甲醇、30 %乙醇、 50 %乙醇、70 %乙醇、乙醇等对红毛走马胎中百两金皂巧B的提取效果，结果W50 %和70 % 的乙醇或甲醇较佳
[0033] 3. 3提取时间优化
[0034] 供试品溶液提取时间考察了 30min、45min、60min、75min、90min的提取效果，结果 15个测定结果的RSD为1. 8%，总的趋势是随超声时间的延长，含量逐渐增加，但60min后 差异很小。最终确定的前处理方法是W50%乙醇为溶剂，超声提取60min。
[00对 4测定方法
[0036] 4. 1色谱条件与系统适用性试验
[0037] 固定相为十八烷基硅烷健合硅胶（Symmetry柱：150mmX4. 5mm，5ym);流动相 为甲醇-水（65 :城准溫为30°C;体积流量为0. 8血?min1;蒸发光散射检测器的漂移 管溫度：95°C;气体流速：2.化?min1;理论板数按百两金皂巧B计算不得低于5000。
[0038] 4. 2对照品溶液的制备
[0039] 精密称取百两金皂巧B对照品10. 72mg于100血量瓶中，加50%甲醇适量，超声 (功率300W，频率40kHz)使溶解，相同溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
[0040] 4. 3供试品溶液的制备
[0041] 取红毛走马胎药材粉末（过=号筛）0. 15g，精密称定，置具塞锥型瓶中，精密加入 50 %乙醇50血，密塞，称定重量，超声（功率300W，频率40曲Z)处理60分钟，放冷，再称定 重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀，离屯、，取上清液，即得；
[0042] 4. 4测定方法
[0043] 分别精密吸取百两金皂巧B对照品溶液5化、20yL;红毛走马胎供试品溶液5~ 10yL;注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得。
[0044] 5方法学验证
[0045] 5. 1线性范围
[0046] 分别精密吸取4. 2项下的白两金皂巧B对照品溶液2. 5、5、7. 5、10、12. 5、15、17. 5、 20yL注入液相色谱仪，测定峰面积值，W进样量的对数狂）为横坐标，峰面积对数灯）为纵 坐标，进行线性回归，回归方程：Y= 1. 782X+6. 912,r= 0. 9998。结果显示，百两金皂巧B 的进样量在0. 268yg~2. 144yg范围内呈良好的线性关系。
[0047] 5. 2仪器精密度试验
[0048] 取百两金皂巧B对照品溶液，在上述色谱条件下进样10yL测定峰面积，重复进样 6次，测得平均峰面积分别为1169mAU*s，RSD为0. 9%，表明仪器精密度良好。
[0049] 5. 3稳定性试验
[0050] 取同一红毛走马胎供试品溶液，分别在0、1、2、4、6、化进样10^以测定百两金皂 巧B的峰面积，测得平均峰面积分别为1227mA肿S，RSD为0. 8%，表明供试品溶液在化内 稳定。
[0051] 5. 4重复性试验
[0052] 取同一批红毛走马胎药材粉末，平行操作6份，按照4项下的测定方法制备样品溶 液并测定，用外标两点法对数方程计算含量，结果平均含量为37. 9mg?g1，RSD为1. 1 %，表 明重复性良好。
[0053] 5. 5加样回收率试验
[0054] 减半量称取已知含量的红毛走马胎药材粉末0. 075g，置50血具塞锥型瓶中精 密称定，平行操作6份，分别W样品百两金皂巧B质量的1 : 1比例精密加入对照品溶液 巧70. 6yg?血1) 5. 0血，蒸干溶剂，按照4项下方法制备供试品溶液并测定，计算回收率，结 果见表1。
[0055]表1加样回收试验结果（n= 6)
[0057] 5. 6耐用性考察
[005引耐用性试验考察了立根不同品牌和长度的。迪对样品的测定，均获得满意的效 果；其柱溫在25°C~35°C范围变化，测定结果均良好；流动相中甲醇：水的比例变化在 60 : 40~70 : 30范围内调整，除保留时间变化外，其余不影响测定结果，说明本方法耐用 性良好。
[00则 6样品测定
[0060] 6. 1药材测定
[0061] 取各批红毛走马胎药材粉末0. 15g，平行操作=份，按照4项下的方法测定并计算 百两金皂巧B的质量分数，结果见表2。由表可知：受±壤、气候、生态环境等地域因素的 影响，不同产地红毛走马胎药材中百两金皂巧B的含量存在较大差异，其全草质量分数在 2. 6%~4. 5%之间；根和茎的质量分数在3. 7%~6. 2%之间。
[0062] 6. 2粗提物测定
[0063] 取四川键为产红毛走马胎药材提取物干燥浸膏粉0.05g，精密称定，平行操作= 份，按照4项下的方法测定并计算百两金皂巧B的质量分数，结果见表2。由表可知：不同 浓度乙醇溶剂提取的红毛走马胎药材提取物其百两金皂巧B含量不同。
[0064] 6. 3精提物测定
[0065] 取四川键为产红毛走马胎药材精提物15mg，精密称定，平行操作S份，按照4项下 的方法测定并计算百两金皂巧B的质量分数，结果见表2。
[0066] 表2不同产地红毛走马胎药材或其提取物*中百两金皂巧B的测定结果（n= 3， #打=2)
【主权项】
1. 一种使用高效液相色谱-蒸发光散射检测法（HPLC-ELSD)测定红毛走马胎药材或 其提取物中百两金皂苷B含量的检测方法，其步骤包括：色谱条件与系统适用性试验、对照 品溶液的制备、供试品溶液的制备、百两金皂苷B含量测定；其中百两金皂苷B含量测定的 方法为：分别精密吸取百两金皂苷B对照品溶液5 y L、20 y L ;红毛走马胎供试品溶液5~ 10 y L ;注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得。2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述色谱条件与系统适用性试验是 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；体积比为60 : 40~70 : 30的甲醇-水为流动相；蒸 发光散射检测器检测；理论板数按百两金皂苷B计算不得低于5000。3. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述对照品溶液的制备采用如下方 法：取百两金皂苷B对照品适量，精密称定，加40~80%甲醇或乙醇制成每1ml含0. 05~ 0. 15mg的百两金皂苷B对照品溶液，即得。4. 根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述百两金皂苷B对照品采用如下 方法自制：将红毛走马胎粉碎，用50 %~80 %乙醇提取，将提取液减压浓缩，上大孔吸附树 月旨，用水和30 %乙醇冲洗除杂，再用80 %乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩干燥，上硅胶柱层析， 以体积比为70 : 30的乙酸乙酯-甲醇洗脱，合并富含百两金皂苷B的流份，除去溶剂，甲 醇重结晶，用制备型高效液相色谱分离纯化，色谱条件：C 18柱；流动相：体积比为60 : 40~ 70 : 30的甲醇-水；检测波长：205nm，收集目标峰流出液，浓缩、干燥，即得。5. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备采用以下方 法：取红毛走马胎药材粉末（过三号筛）0. 1~0. 2g，精密称定，置具塞锥型瓶中，精密加入 50~70%的乙醇或甲醇25~100mL，密塞，称定重量，超声处理50min以上，取出，放冷，再 称定重量，用相同溶剂补足减失的重量，摇匀，过滤或离心，取续滤液或上清液，即得。6. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述超声处理指超声功率200~ 400W，频率 30 ~50kHz。7. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述采用HPLC-ELSD法测定百两金皂 苷B含量包括如下步骤及优化条件： 照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录VI D)测定； 色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；体积比为65 : 35 的甲醇-水为流动相；蒸发光散射检测器检测，理论板数按百两金皂苷B计算不得低于 5000 ； 对照品溶液制备取百两金皂苷B对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1ml含 〇. Img的百两金皂苷B对照品溶液，即得； 供试品溶液制备取红毛走马胎药材粉末（过三号筛）〇. 15g，精密称定，置具塞锥型瓶 中，精密加入50 %乙醇50mL，密塞，称定重量，超声（功率300W，频率40kHz)处理60分钟， 放冷，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液，即得； 测定方法分别精密吸取对照品溶液5 y L、20 y L ;供试品溶液5~10 y L ;注入液相色 谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得。
【专利摘要】本发明建立了一种红毛走马胎药材或其提取物的定量分析方法，该方法采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)测定其中活性成分百两金皂苷B的含量，从而使其内在质量能够得到客观科学的评价。该方法精密度、稳定性、重复性、加样回收率、耐受性等均符合定量分析要求。利用该法首次测定了不同产地红毛走马胎药材的含量，为含百两金皂苷B成分的药物开发提供了新的质量控制检测手段。
【IPC分类】G01N30/02
【公开号】CN105116059
【申请号】CN201510280393
【发明人】张琦, 伍红, 陈炼红, 饶开晴
【申请人】西南民族大学
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年5月27日