时间分辨激光诱导荧光光谱系统及其用图
【专利说明】时间分辨激光诱导荧光光谱系统及其用途 政府权利
[0001] 本发明在由国立神经疾病和中风研究所授予的NS060685号资助下由政府支持获 得。政府对本发明享有某些权利。
技术领域
[0002] 本发明通常涉及通过分析来自标记或未标记生物分子的激光诱导光发射来表征 生物材料的技术。
【背景技术】
[0003] 本文所引用的所有参考仿佛完全阐述一般以整体方式并入。除非另外定义， 否则本文所使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解 的意义相同的意义。下述文献为本领域中技术人员提供用于本申请的许多术语的通 用指导：A1 Ien 等人，〈〈Remington:The Science and Practice of Pharmacy》第 22 版·，英国医药出版社（Pharmaceutical Press) (2012 年 9 月 15 日）；Hornyak 等人， 《Introduction to Nanoscience and Nanotechnology》，CRC 出版社（2008) ；Singleton 和 Sainsbury,《Dictionary of Microbiology and Molecular Biology》第 3 版·，修订 版·，约翰·威利出版社（J.Wiley&Sons)(纽约，NY 2〇〇6) ;Smith,《March' s Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure〉〉第 7 版·，约翰·威利出 版社（纽约，NY 2013) ;Singleton,《Dictionary of DNA and Genome Technology》第 3版·，威立布莱克维尔出版社（Wiley-Blackwell) (2012年11月28日）；以及Green 和 Sambrook,《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》第 4 版·，冷泉港出版社 (Cold Spring Harbor Laboratory Press)(冷泉港，纽约2012)。关于如何制备抗体的 参考，参见如下文献：Greenfield,《Antibodies A Laboratory Manual》第 2版·，冷泉 港出版社（冷泉港，纽约 2013) (Cold Spring Harbor NY，2013) ; KShler 和 Milstein， ((Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion》，欧洲免疫学杂志（Eur.J. Immunol. ) 1976 年 7 月，6(7) :511-9 ;Queen 和 Selick,《Humanized immunoglobulins》，美国专利号 5,585, 089 (1996 年 12 月）；以及 Riechmann 等人，((Reshaping human antibodies for therapy)),自然（Nature) 1988 年 3 月 24 日，332(6162):323-7。
[0004] 激光诱导荧光光谱（LIFS)已被广泛地应用于复杂的生物系统以诊断疾病，例如 肿瘤或动脉粥样硬化斑块，以及分析有机物的化学或生物化学成分。LIFS的益处包括其在 活体内获取定性和定量的生物系统信息的无创性途径（noninvasive approach)。LIFS的 其他优势包括波长可调谐性、窄带激发、指向性和短脉冲激发。另外，LIFS能够选择性并有 效地激发有机物中的荧光团并极大地提升荧光选择性和可检测性。
[0005] 时间分辨技术使得激光诱导的发射的实时演化被直接地记录，短（纳秒）和极短 (皮秒）脉冲激光的可用性以及高速电子设备的进展使得此直接记录过程成为可能。由于 光发射过程发生在刺激事件后非常短的时间间隔内（例如，荧光衰减时间大约为几纳秒）， 时间分辨测量可提供关于样本的分子种类和蛋白质结构的信息。例如，时间分辨技术允许 将测量数据中的"早期"过程（典型地为短期状态的直接激发或非常快速的后续反应）和 "后期"过程（典型地为长期状态，由持续电子布居或由初始电子过程后的反应所导致的延 迟激发）"分离"。
[0006] 时间分辨测量仅从宽范围的波长中获取整体效应，并且可由激光诱导发射中的光 谱信息补充，以揭示样本的额外特征。为了将激光诱导发射分解成组分波长，同时仍然能 够执行时间分辨测量，一些现有的LIFS技术使用扫描单色仪从宽频发射中选择波长，每次 一个波长，并且将选择的波长组分导向光电探测器。然而，当调谐单色仪以选择新波长的时 候，为了从发射光谱中分解另一个波长，样本需要再次激发以产生另一个再发射。
[0007] 此类现有的技术会耗费大量的时间以从宽带光发射中分辨出多个光谱组分。尽管 每个波长组分都可被实时记录，但是使用单色仪选择另一个波长的转换时间可花费数秒， 这在执行实时测量中成为限制因素。另外，如果需要测量样本上的大量刺激位置，总体测量 会花费大量时间。因此，需要促进来自单次样本激发引起的光发射的时间分辨和波长分辨 信息的接近实时记录的系统和方法。 发明概述
[0008] 本发明提供了一种通过分析来自生物样本的光发射来表征生物样本的系统，其 中，生物样本对激发信号进行响应而产生所述光发射。系统首先用激光脉冲辐射生物样本 以促使生物样本产生响应光发射。系统随后使用波长分割装置将响应光发射分割成不同中 心波长的光谱带组。随后向光谱带组应用时间延迟，使得每个光谱带在不同时间到达光学 检测器，从而使光学检测器分别瞬时分辨每个光谱带的响应光发射。延迟的光谱带随后由 系统在光学检测器的单个检测窗口中捕获。随后处理捕获的光谱带。
【附图说明】
[0009] 图1根据本发明的不同实施方案描述了，（A)多点激发时间分辨激光诱导焚光光 谱的原理图。BS :分光镜；FB :光纤束；OD :光密度；LPFW :长通道滤光轮；ExF :激发光纤； CF :收集光纤；PMT :光电倍增管。（B)触发同步。
[0010] 图2根据本发明的多个实施方案描述了示例性多路分配器设计的原理图。
[0011] 图3根据本发明的多个实施方案描述了探测器的原理图。
[0012] 图4根据本发明的多个实施方案描述了多个示例性生物分子的荧光发射。
[0013] 图5根据本发明的多个实施方案描述了显示离体脑样本中持续NADH监测的使用 的原理图。
[0014] 图6根据本发明的多个实施方案描述了这样的数据：该数据展示了 TRLIFS装置在 细胞暴露于鱼藤酮（一种干扰NADH-依赖性ATP产生的化合物）中时持续监测NADH水平 的能力。
[0015] 图7根据本发明的多个实施方案描述了，（A)由TRLIFS系统观测到的区域；(B)来 自于（A)的样本在用TTC处理后被覆盖；以及（C)为每个区域（点）标绘的荧光强度。
[0016] 图8根据本发明的多个实施方案描述了具有不同浓度甲氨蝶呤的琼脂/凝胶。
[0017] 图9根据本发明的多个实施方案描述了，（A)在暴露于具有350nm波长的光20分 钟之后不同浓度的MTX的荧光，以及（B)在20分钟内的荧光时间进程的曲线图，其指示由 于形成活性荧光形式而导致MTX的荧光增加。 发明详述
[0018] 本文引用的所有参考文献都如同充分阐述一般以引用方式整体并入。除非另外 定义，否则本文使用的技术术语和科学术语具有与本发明所属领域中的普通技术人员通 常所理解的相同的含义。下述文献为本领域中的技术人员提供用于本申请中的许多术语 的通用指导：Alien 等人，《Remington:The Science and Practice of Pharmacy》第 22 版·，英国医药出版社（2012年9月 15 日）；Hornyak等人，Introduction to Nanoscience and Nanotechnology, CRC 出版社（2008) ;Singleton 和 Sainsbury,《Dictionary of Microbiology and Molecular Biology》第3版·，修订版，约翰·威利出版社（纽约，NY 2006) ；Smith, ((Marchi s Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure》第 7版·，约翰·威利出版社（纽约，NY 2013) ;Singleton,《Dictionary of DNA and Genome Technology》第3版，威立布莱克维尔出版社（2012年11月28日）；以及 Green和 Sambrook,《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》第4版，冷泉港出版社 (冷泉港，纽约2012)。关于如何制备抗体的参考，见于下述文献：Greenfield,《Antibodies A Laboratory Manual》第2版，冷泉港出版社（冷泉港，纽约2013) ;.Kdhler和Milstein, ((Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion》，欧洲免疫学杂志 1976 年7 月，6(7) :511-9 ;Queen 和 Selick,《Humanized immunoglobulins》，美国专利号 5, 585, 089(1996 年 12 月）；以及 Riechmann 等人， 《Reshaping human antibodies for therapy》，自然 1988年 3月 24 日，332(6162) :323_7。
[0019] 提供以下描述以使得本领域的任何技术人员能够制造和使用本发明，并在特定申 请和其需求的背景下提供。本领域的技术人员将容易明白对这些实施方案的各种修改，并 且本文定义的一般原则可以应用于其他实施方案而不背离本发明的精神和范围。因此，本 发明不局限于所示的实施方案，而是根据与权利要求一致的最宽广的范围。
[0020] 本发明涉及通过分析来自（标记或未标记的）生物分子的激光诱导光发射来表征 生物材料的技术。更具体地说，本发明涉及通过对来自生物材料的激光诱导的荧光发射执 行时间分辨分析和波长分辨分析来表征生物材料的方法和装置。
[0021] 本文所描述的系统可被用于表征多种生理状态和疾病状态，包括但不限于，评估 损伤后组织活力、检测肿瘤和癌旁组织、持续监测细胞新陈代谢、监视血浆以便优化药物治 疗。系统可根据被分析的底物/标记而适用于不同的应用/用途。 系统
[0022] 激发源为脉冲激光器100。来自脉冲激光器的输出脉冲以适合用于激发生物样本 101而不对样本造成伤害的预定波长和功率电平（power level)福射在生物样本上。脉冲 激光器由内部或外部脉冲控制器装置或数字延迟装置或触发装置102控制，其为每个激光 脉冲输出提供精确的时间。此精确的时间在每个脉冲中用光电二极管检查并用模数转换器 装置如NI PCIe-6220更新。在一个实施方案中，脉冲激光器发射紫外（UV)光脉冲以激发 生物样本。在另一个实施方案中，脉冲激光器发射可见光脉冲或近红外光脉冲以激发生物 样本。
[0023] 脉冲激光器发射的激光可被连接/聚焦进光纤中，并通过光纤103 (图3)或透镜 系统被引导到生物样本中的特定位置。激光脉冲激发促使生物样本产生响应光发射，例如 荧光发射，其典型地具有包括多个波长的宽光谱。激光诱导光发射随后被一个或多个光采 集光纤或透镜所采集。在本发明的一个实施方案中，光采集光纤为一束多模式光纤103。在 另一个实施方案中，光采集使用物镜完成。
[0024] 随后，光采集光纤将宽带发射光导入到波长分离装置104(图2)中，其可包括一个 或多个波长分离阶段。宽带发射光经历一系列波长分离处理，使得宽带信号能被分解成多 个窄光谱带，其中每个窄光谱带都具有不同的中心波长。波长分辨光谱带被连接至相应的 延迟装置105,其在每个光谱带朝光电探测器106行进时对每个光谱带应用预定的时间延 迟。离开延迟装置的时间延迟光谱带被布置在快速响应光电倍增管上，使得包括激光的每 个波长分辨的光谱带的荧光衰减曲线都能够被独立记录并瞬间分辨。应用于这些光谱带的 延迟使得每个光学信号在不同时间到达多通道光电倍增管（MCP-PMT)，这使得每个光谱带 的衰减曲线都可与激光一起被MCP-PMT分别检测到。在一个实施方案中，来自MCP-PMT的 输出可用高速数字化仪107记录并显示。在另一个实施方案中，来自MCP-PMT的输出可用 示波器记录并显示。在一个实施方案中，MCP-PMT是由门控电路控制的门控MCP-PMT，使得 MCP-PMT仅在MCP-PMT打开时的窄检测窗口中响应于光信号。在一个实施方案中，门控电路 和脉冲控制同