三苯基四氮唑）的溶液中，所述溶液当被可成活细胞吸收时使细胞变 红。TTC是目前用于测试可成活细胞的黄金标准。将TTC染色组织与记录的荧光强度比较。
[0057] 可以观察到NADH自发荧光的从健康组织（图7中染红区域）到死亡组织（图7 中未染色区域）的平滑的梯度。我们还注意到，并非如TTC染色所见的从可成活到死亡组 织的突然改变，荧光强度（图7)逐渐改变，这暗示了在指示死亡的区域存在可成活细胞。 实施例3 使用荧光来测定血浆中的药物/代谢物水平
[0058] -些抗癌药物在高剂量是有毒的，而在低剂量又会失去其功效。由于身高、体重、 新陈代谢和种族的不同，药物最有效的最理想的药物血浆浓度（治疗窗口）在患者之中变 化。尽管有这些不同，如今的药物剂量是基于患者的体重和标准药代动力学曲线计算的。测 定血浆药物水平的快速廉价的方法可以优化用于单个患者的剂量。血浆的药物水平可用荧 光光谱学检测。众所周知，一些抗癌药物如甲氨蝶呤具有荧光属性。本申请人证明使用本 文所述的TRLIFS系统，改变甲氨蝶呤（MTX)在琼脂中的浓度（图8)，导致MTX的荧光性的 相应变化。
[0059] 为了激发琼脂凝胶，具有Q开关的以350nm的波长发射的NchYaG激光器被使用， 以IKHz随着400ps的脉冲宽度（FWHM)运行（Teem Photonics PNVM02510)。每个脉冲的总 能量不超过5yj，这防止NADH的光致漂白。激发光用定制的三叉光探针传递到凝胶。探针 包括用来传递激发光的中心的600微米光纤，其被十二根用来采集荧光的200微米光纤环 绕。来自12条采集光纤中的每个其他光纤都被结合到一起形成两个通道。一个采集通道 /束移动到分光仪（Ocean Optics，Maya)，其每IOOrns测量荧光光谱，而另一个通道/束连 接到光束分割器（多路分配器）。
[0060] MTX的连续稀释液（25 μ g/ml至25ng/ml)在琼脂凝胶中制备。当曝露于紫外光 时，MTX改变成更加具有荧光性的形式。在曝露于紫外光时，荧光形式积聚。为了检测荧光 形式，允许从低荧光到荧光形式的变化发生直到达到饱和水平。最终荧光强度被记录并与 浓度比较。在20分钟的紫外光曝露后的MTX的荧光强度良好指示MTX在琼脂凝胶中的浓 度，如图9中所示。 实施例4 肿瘤检测
[0061] 激光诱导荧光光谱（LIFS)代表用于活体内诊断中有前途的新的附加技术。荧光 光谱涉及激发组织中的内在荧光团（无标记）和记录发射。可以以两种方式应用荧光光谱， 稳定状态或时间分辨荧光光谱。时间分辨测量将荧光强度衰减按照生命周期分解，并因此 提供关于荧光强度衰减的潜在动力学的附加信息。时间分辨测量还独立于如下因素：例如 被组织固有荧光团（例如，血液）吸收，光漂白或任何其他可能影响荧光强度的条件。通过 测量焚光衰减特征，这反映了不同焚光分子的弛豫动力学（relaxation dynamics)中的不 同，时间分辨测量能够分解重叠光谱以及提升荧光测量的特异性。
[0062] 申请人证明在患者中，本文所述的TR-LIFS系统能够在手术中将胶质肿瘤（重度 和轻度）与周围正常脑组织区分开。此研究可确立TR-LIFS增强神经外科医生-神经病理 学家团队在手术中迅速辨别肿瘤和正常脑的能力的可能性。
[0063] 使用仪器：实验通过允许以光谱分辨方式进行荧光寿命测量的仪器设置来执行。 在图1中示出了本装置的光学和电子布局的原理图。简略地，其包括：a)脉冲的具有Q开 关的 NchYaG 激光器（Teem Photonics，型号 Teem Photonics PNVM02510, λ = 350nm,脉 冲宽度=400ps FWHM，脉冲速率=lKHz)，其被用作激发源；b)定制的可灭菌的三叉光纤探 针（美国Fiberguide公司，新泽西州（NJ)) ;c)带门控的多通道板光电倍增管（MCP-PMT Photek公司，英国，型号210，上升时间=80ps)，其具有可选的快速前置放大器（Photek 公司，英国，型号PA200-10, 2GHz) ;e)数字化仪（型号是ADQ-108, SP Devices公司，斯 维登，7 千兆样本 / 秒）（ADQ-108, SPDevices, Sveden, 7 Gsamples/sec);以及 f)笔记本电 脑；g)定制的多路分配器，如图1中所示，以及外围的电子设备。当仪器被包含在局部改造 以适应个别装置的标准内窥镜匣（70X70X150cm3)中时，其允许可移动性。为了保证来自 所用的电子设备的低噪音水平，如高电压电源和前置放大器电源，所有仪器都用医疗等级 的隔离变压器（Toroid? ISB-170A)与电力网供电屏蔽开。
[0064] 递送导管：用定制的二叉可灭菌探针实施光递送和采集。探针包括0. 11数值孔 径（NA)未曝光过度的二氧化硅/二氧化硅步进指数纤维（Fiberguide公司，新泽西，NJ)。 其具有600 μ m核心直径的中心激发光纤，由十二根200 μ m核心直径的光纤的采集环包围。 所有采集光纤都被结合到一起并组成单个600微米光纤。激发光纤和采集光纤之间中心到 中心的分隔为480 μ m。除了 7cm的末端部分是刚性不锈钢管的，探针在其整个长度（3米） 上是柔性的。这有利于了探针的装备和显微操作。在对立面具有两个裂缝的垫片被添加在 探针的远侧端部的前方。这允许探针在与组织保持固定距离时与组织接触。垫片上的两个 裂缝使得外科医师能够采用抽滤管来维持清晰视野。当采集通道的远侧端部形成直线以便 促进连接到光谱仪时，用标准SM连接器将激光连接进探针的照明通道。在组织激发后，发 射的荧光被束一采集并导入到多路分配器的入口裂缝并且通过束二导入到分光仪。信号随 后被MCP-PMT检测到，由快速前置放大器放大，并最后被数字示波器以8位分辨率数字化。 系统的总时间分辨率为大约150ps。
[0065] 光纤探针在垫片的帮助下被定位在暴露的脑组织样本上方3mm，以优化探针光采 集效率（如之前所报告的）并在组织上方使探针稳定。每个样本的时间分辨发射都被记 录在七个分别的波长带（355 (<365nm))、365-410nm、415-450nm、450-490nm、500-560nm、 560-600nm和>600nm)光谱范围里。用于样本激发的激光的能量输出（在光纤的尖端）被 调整到5. 0 μ J/脉冲。在光谱学分析后，组织在精确的位置被活组织切片检查并送到病理 学研究。
[0066] 每个切片样本都被固定在10%缓冲福尔马林中。组织样本被固定在载玻片上并 被Η&Ε染色。所有切片样本都被病理学家研究并与初始荧光光谱测量结果相关联。组织结 构上，基于WHO分级，胶质瘤被分类为低等级：少突神经胶质瘤（Oligodendroglioma)、混合 型少突星形细胞瘤（oligodendroastrocytoma)、扩散星形细胞瘤（diffuse astrocytoma) (WHO等级II);中间等级：间变型星形细胞瘤（anaplastic astrocytoma) (WHO等级III); 以及高等级：间变型少突神经胶质瘤（anaplastic oligodendroglioma)、间变型少突 星形细胞瘤（anaplastic oligodendroglioma)和多形性成胶质细胞瘤（glioblastoma multiforme)(等级III-IV)。出于在此研究中光谱分类的目标，神经胶质瘤被分类为低等 级神经胶质瘤（LGG)(等级I和II)和高级神经胶质瘤（HGG)(等级III和IV)。
[0067] TR-LIFS数据分析：在TR-LIFS的背景下，固有荧光脉冲响应函数（IRF)，h (η)，描 述荧光衰减的实际动力学。IRF由测量的输入激光脉冲从测量的荧光响应暂态的数值去卷 积获得。拉盖尔展开技术（Laguerre expansion technique)被用于去卷积。出于一组理 由，优于更常规多项指数曲线拟合来选择拉盖尔展开技术。它允许荧光IR的更快去卷积。 由于拉盖尔基础是标准正交的，它提供衰减函数的唯一和完整的展开。此技术也是无参数 的，因此不需要衰减函数形式的预先假设。因此，这允许将荧光系统近似用于如生物组织的 未知和复杂缓冲动力学法。此方法允许从实验输入-输出数据来直接恢复动力学系统的 固有属性。所述技术使用标准正交的拉盖尔函数展开IRF并估算拉盖尔展开系数（LEC)。 标准的荧光光谱通过将离散强度值除以最大发射时的强度值来获得。另外，为了表征荧光 衰减的时间动力学，使用两组参数：1)平均寿命（τ λ)，计算为IRF衰减到其最大值的内插 时间，以及2)相应LEC的标准值。因此，从每个样本作为发射波长λ Ε的函数的荧光的完 整描述通过一组光谱参数在不同波长下的变化来给出（发射强度_Ιλ，荧光发射的平均寿 命-τ "，以及拉盖尔系数LECf)。用于表征荧光衰减的此分析性方法最近由我们的研究团 队开发出并在别处详细描述。申请人能够恢复寿命和拉盖尔系数值。
[0068] 上述各种方法和技术提供若干实现本申请的途径。当然，应理解根据本文中描述 的任何特定实施方案不一定可以实现所述的所有目标或优势。因此，例如，本领域技术人 员将认识到，所述方法可以以实现或最优化如本文中教导的一个优势或一组优势的方式进 行，而不一定需要实现本文中教导或指出的其他目标或优势。本文中提到多种替代方案。应 理解，一些优选实施方案专门地包括一个、另一个或几个特征，而其他的实施方案专门地排 除一个、另一个或几个特征，而又一些其他的实施方案通过包括一个、另一个或几个有利的 特征而弱化特定的特征。
[0069] 此外，本领域技术人员将认识到来自不同实施方案的各种特征的适用性。类似地， 本领域的普通技术人员可以以各种组合使用上述各种元素、特征和步骤以及各个这样的元 素、特征或步骤的其他已知等效物来执行根据本文中描述的原理的方法。在不同的实施方 案中，所述各元素、特征和步骤中的一些将被专门地包括而其他的则被专门地排除。
[0070] 虽然已经在某些实施方案和实施例的上下文中公开了本申请，但是本领域技术人 员将理解，本申请的实施方案将专门公开的实施方案扩展到其他替代实施方案和/或用途 以及其修改和等效物。
[0071] 在一些实施方案中，在描述本申请的特定实施方案的环境（特别是在某些下列权 利要求的环境中）中使用的术语"一个"和"一种"和"所述"和类似的引用可以理解为涵盖 单数和复数。本文中列举的数值范围仅仅希望作为单独提及落入范围中的每个独立数值的 简写方法。除非本文另外指明，否则每个单独数值均并入在本说明书中，如同本文单独列举 每个单独数值一样。可按任何合适的顺序来执行本文所述的所有方法，除非本文另外指明 或明显地与上下文矛盾。使用相对于本文中的某些实施方案提供的任何和所有实例或示例 性语言（例如，"如"）的目的仅仅是希望更好地阐明本申请而不对另外要求的本申请施加 限制。不应该将说明书中的语言理解为表示对实践本发明必需的任何未要求的要素。
[0072] 本文中描述了本申请的优选实施方案，包括发明人已知的实现本申请的最佳方 式。通过阅读上述描述，那些优选实施方案的演变形式对普通技术人员而言将变得显而易 见。预计本领域技术人员可以适当地使用这些演变形式，并且可以用本文中特定描述的其 他方式实践本应用。因此，经适用的法律许可，本申请的许多实施方案包括在此附加的权利 要求中叙述的所有标的物的改良形式和等价物。此外，除非另外在文中指出或明显与上下 文矛盾，否则本申请涵盖所有可能的演变形式的上述元素的任何组合。
[0073] 本文中提及的所有专利、专利申请、专利申请公布和其他材料（如论文、书籍、说 明书、出版物、记录、事物和/或类似的东西）均在此通过引用的方式全部并入本文以达到 所有目的，与上述文件相关的任何起诉文档记录、与本文件不一致或冲突的任何上述文件 或对迟早与本文件相关的权利要求书的广泛范畴有限定作用的任何上述文件除外。举例来 说，如果任何并入材料相关的与本文件相关的描述、定义和/或术语使用之间有任何不一 致或冲突，那么本文件中的描述、定义和/或术语使用应当优先。
[0074] 最后，应理解本文中公开的本申请的实施方案是本申请的实施方案的原理的说 明。可以使用的其他修改可以在本申请的范畴之内。因此，举例来说，但不限制，可以根据 本文中的教导使用本申请的实施方案的替代构造。因此，本申请的实施方案不严格限于如 图所示和所述的实施方案。 参考文献 Butte, P. V，Fang, Q.，Jo, J. A.，Yong，W. H.，Pikul，B. K.，Black, K. L.，和 Marcu，L. (日期不详）.使用时间分辨荧光光谱进行原发性脑瘤手术概述.生物医学光学杂 志，15(2)，027008.(1〇1:10.1117/1.3374049(811?6，？.￥汁&叫，0.，了〇，了.厶.，￥〇叫，1 H. , Pikul, B. K. , Black, K. L. , &Marcu, L. (n. d. ). Intraoperative delineation of primary brain tumors using time-re