TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses).〈〈分析化学》 84(17):7469-78)。质量亏损（此细微质量变化的原因）由以下事实引起：核结合能（使 核分解成其组分核子所需的能量）对于每种元素的每种同位素不同。串联质量标签方法 仍依赖于基于MS/MS的定量，然而，不分辨同量异位素标记的准确度和再现性问题。表明 除C和N之外，其它元素可以编码中子质量签名。实际上，质量亏损可以由许多元素和其 同位素诱导：例如 12C/13C(+3. 3mDa)、4/2!1(+6· 3mDa)、160/1s0(+4. 2mDa)、14Ν/15Ν(-3· OmDa)和 32S/34S(-4. 2mDa)。假设这些同位素向蛋白质组中的计算并入将生成新的MSl-中心定量技 术，所述技术将SILAC的准确度与同量异位素标记的复用能力组合。此方法已经称为中子 编码（NeuCode) 〇
[0124] 与使用NeuCode对蛋白质组进行质量标记相对比，所公开的方法使用质量亏损的 概念产生经标记的肽标准物以用于对分析物进行绝对定量。
[0125] 在经标记的肽标准物的产生中使用这些质量亏损利用了同位素之间的核结合能 的细微差异。所述方法有效地将同位素信息压缩到非常窄的m/z空间（约0.0050-0. 040) 中，以便其容易通过改变质量分辨率而隐蔽或展现。当前傅里叶变换MS系统提供了超高分 辨率（>1，〇〇〇, 〇〇〇)，并且将允许使用分隔少到约6mDa的质量亏损标记的肽。在一个具体实 施方式中，产生提供7重定量的定制赖氨酸同位素物的合成：+8Da，在0、6、12、18、24、30和 36mDa间距下（图6、7a-b)。此外，所述>7重同位素物集合可以用12个额外中子生成，允 许组合多个同位素簇中的同位素物。举例来说，每种肽将存在于三个同位素簇中，就如在传 统三重中一样；然而，每个簇在高分辨率扫描分析时将展现5-7个独特峰。通过组合含有赖 氨酸的这19种同位素物（5+7+7)的肽，质量亏损标记应促进19重实验。类似地，通过将含 有精氨酸同位素物的8重同位素物集合与6和10个额外中子组合，同样可以对含精氨酸的 肽进行16重复用定量。通过将相对和绝对定量的质量亏损与质量差示标签组合，实现高度 复用定量准确度和精密度。
[0126] 同位素物质量标签测定
[0127] 共价质量标签是一种产生内标肽同位素物的同位素物集合的替代性方法。质量标 签的化学结构具有较大柔性，并且因此这些化学标签更容易经特定手性氨基酸前体的合成 而合成。同位素物质量标签可以用以标记非蛋白质样品，包括核苷酸、聚糖、脂质和代谢物。 另外，同位素物质量标签可以并有改良溶解度、色谱滞留性质、离子化效率和/或肽碎片化 特性的独特特征。描述两种例示性核心结构和其相关胺反应性标签（图9)。这些例示性标 签是基于经胺反应性N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)修饰的三嗪环和嘌呤杂环结构。这些标签可 以如本领域中已知在无重同位素的情况下或在重同位素的不同组合的情况下合成。轻和重 同位素试剂可以具有4Da的最小质量差异。展示重三嗪和嘌呤核心分子的可能同位素物和 质量（图10a-b)。这些同位素物可以用以产生可以在>100, OOO分辨率下分辨的复用试剂 集合。在一个【具体实施方式】中，以确定比例预混合重同位素物。用蛋白酶（如胰蛋白酶或 LysC)消化分析物蛋白质样品，并且将轻标签通过反应性胺在肽和赖氨酸残基的氨基末端 处共价连接到肽。将用以对靶分析物肽进行定量的已知绝对浓度的内标肽用重同位素物标 签集合标记。在低分辨率下，轻靶向分析物的曲线下面积（AUC)和重同位素物集合的复合 AUC可以用以对目标分析物进行定量，并且在高分辨率下，内标同位素物可以用以界定用于 对靶分析物进行更准确定量的标准曲线。
[0128] 通用报告子测定
[0129] 通用报告子的使用描述于WO 2012/005838和WO 2012/006406中。此方法导致 通过MS对分析物进行绝对定量，并且使得能够对参考溶液中的分析物进行简单浓度校准。 所述方法使用重同位素标记的分析物（内标物），其与报告子R(其可以或可以不经重同位 素标记）具有等摩尔浓度并且可裂解地缀合到报告子R ;和重同位素标记的通用报告子U。 分析物包括但不限于肽、多肽和蛋白质。通用报告子U包括但不限于肽（即，氨基酸的聚合 物）和其它聚合物。
[0130] 在一个【具体实施方式】中，本发明方法使得通过MS对肽、多肽和蛋白质分析物进行 绝对定量。所述方法使用重同位素标记的肽（蛋白质型肽，下文描述；内标物），其以与任 选地重同位素标记的报告子肽R等摩尔浓度存在，并且在蛋白水解位点处可裂解地缀合到 所述报告子肽R ;通过氨基酸分析来分析的重标记的通用报告子肽U。重同位素标记的肽不 必经历氨基酸分析。在一个【具体实施方式】中，分析键联到单独报告子肽R的来自单一蛋白 质的若干不同蛋白质型肽。在一个【具体实施方式】中，分析键联到单报告子肽R的串接到一 种多肽中的若干不同蛋白质型肽。
[0131] 图11展示来自蛋白质或多肽P的蛋白质型肽A、B和C。蛋白质型肽是在MS解 离之后碎片化为可预测离子系列，以允许对母蛋白质（无论呈提纯形式还是来自复杂混合 物）进行特定鉴别和定量的签名肽（signature peptide)。其具有使其容易定量的特征。 签名肽是特定蛋白质的明确标识。任何蛋白质含有10与100种之间的签名肽。任何签名 肽都满足大部分以下准则：容易通过质谱检测，可预测地并且稳定地由液相色谱（LC)柱洗 脱，通过反相高效液相色谱（RP-HPLC)富集，良好离子化，和良好碎片化。容易定量的肽满 足大部分以下准则：容易合成，能够经高度提纯（>97% )，可溶于多20%乙腈中，低非特异 性结合，氧化抗性，合成后修饰抗性，和多10并且< 40的疏水性或疏水性指数。疏水性指 数描述于明确地以引用的方式并入本文中的克罗欣（Krokhin)，《分子与细胞蛋白质组研 究》(Molecular and Cellular Proteomics) 3 (2004) 908 中。疏水性指数小于 10 的肽将无 法可再现地通过RP-HPLC分辨。疏水性指数大于40的肽将无法可再现地从RP-HPLC柱洗 脱。
[0132] 本发明方法使用内标物，其是待定量的分析物的重同位素物（标记）形式，也称为 AQUAplex重分析物并且展示于图16中。在使用蛋白质型肽同位素物集合的实施例中，内 标物是蛋白质型肽的经标记的同位素物集合，也称为重蛋白质型肽同位素物，如图17中所 不。
[0133] 同位素稀释质谱分析（IDMS)是指使用重同位素标记的肽作为内标物以确定浓度 对比MS响应关系和对肽进行绝对定量。重同位素标记的肽具有与未标记的肽相同的性质， 不同之处在于其质量因并入的同位素偏移。由于此质量偏移，已知量的同位素标记的肽可 以用作肽定量的内标物。IDMS方法导致对复杂样品或混合物中的肽进行靶向质谱（选择离 子监测（S頂)/选择反应监测（SRM)/多反应监测（MRM))定量。S頂和SRM涵盖MS获取设 置以通过分别对来自一系列靶蛋白质的蛋白质型肽的母或特定碎片离子进行定量，来对这 些靶蛋白质进行定量。靶向测定开发必须是快速的，具有高通量，是灵敏、特异、靶向、稳定、 可再现并且经济的；其典型地使用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS，LC/MS 2)。然而，在靶向 蛋白质组研究实验中使用SRM对大量肽的精确定量由于特异性和占空比需求而保持具挑 战性。SRM特异性是指选择针对靶和内标肽以高灵敏度提供特定定量响应的母/碎片离子 组合（例如，跃迀）。占空比是指在复用SRM测定中可以通过MS同时监测的SRM跃迀的受 限数目。为了解决占空比限制，SRM方法典型地经安排或定时，以便给定靶的跃迀仅在对于 给定靶预期的滞留时间窗中监测到。这在数据获取和可再现色谱之前需要复杂SRM方法设 置，以确保在用于准确AUC测定的峰前后靶跃迀以充足基线完全监测。S頂监测包括分离和 富集靶向肽和内标物以便改良测定的灵敏度。以高分辨率MSl扫描获取的AQUAplex测定 不需要安排或选择跃迀，并且所有定量数据分析都可以在获取后进行。
[0134] 在IDMS中，天然蛋白质型肽仅归因于并入重氨基酸而不同于重蛋白质型肽。重 氨基酸含有 13C (碳的重同位素）和/或15N(氮的重同位素）、180(氧的重同位素）和/ 或 2H(氮的重同位素），并且这些同位素的不同组合可以组合以产生含有相同单位质量但 以高分辨率质谱可观察的略不同准确质量的同位素物集合。插入重氨基酸同位素物产生 HeavyPeptide AQUAplex，其仅因质量差异而不同于蛋白质型肽。使用制备型高效液相色谱 (HPLC)将重肽同位素物混合物的纯度增加到>97%。通过氨基酸分析测定HeavyPeptide AQUAplex的精确量。待定量的肽与HeavyPeptide AQUAplex作为内标物的混合物在低分 辨率质谱分析中产生两个峰：两个峰具有相同洗脱时间，但具有不同质量。在高分辨率MS 下，HeavyPeptide AQUAplex集合将分辨为因同位素物之间的质量亏损而分隔的独特组分 质量。含有2H的肽在反相HPLC上可以展现滞留时间的轻微减少，但这不影响定量准确度， 因为其不影响AUC定量。将HeavyPeptide AQUAplex以已知量加标到待分析的样品中，使 得可能使用其量从峰面积计算待分析的肽的量。在低MS或MSn分辨率下，所述方法将来 自重同位素标记的肽同位素物集合的相应组合MS峰的AUC与具有来源于正在定量的分析 物（例如，聚合物、蛋白质、肽或多肽）的确切相同序列的未标记的肽的峰比较。在高MS或 MSn分辨率下，所述方法将来自重同位素标记的肽同位素物中的每一者的相应MS峰的面积 与具有来源于正在定量的分析物（例如，聚合物、蛋白质、肽或多肽）的确切相同序列的未 标记的肽的峰比较。定量精密度与添加到样品中的重肽的量的准确度直接相关。
[0135] 以下实例（虽然具体用于蛋白质分析物情况）示例说明了可适用于分析物（无论 是蛋白质还是非蛋白质）的通用方法。将含有众多蛋白质的样品（例如，生物样品、食物样 品）用裂解剂，如蛋白酶（例如，胰蛋白酶）进行处理。胰蛋白酶在每个R氨基酸和K氨基酸 处裂解，产生众多碎片，每个碎片具有约13种氨基酸（从6种氨基酸到20种氨基酸变动）。 向此待分析的含碎片的样品中引入（加标）一种、两种或三种HeavyPeptide AQUAplex内 标物，并且如所述进行定量。在使用蛋白水解消化的实施例中，定量精密度还与消化可预测 性和效率直接相关。
[0136] 在一个【具体实施方式】中，蛋白质含有一种、两种或三种蛋白质型肽序列，标记为重 或轻（HeavyPeptide AQUAplex)。将待分析的样品用蛋白质型肽加标并且通过LC-MS/MS定 量。
[0137] 在AQUAplex IDMS中，内标同位素物集合具有与来自待定量的蛋白质的蛋白质型 肽相同的序列，但内标物是具有与蛋白质型肽不同的质量的重同位素物的混合物。内标物 的序列因此通过蛋白质序列进行预确定；其不能改变。AQUAplex内标物必须通过氨基酸分 析来定量以测定总肽浓度，并且通过高分辨率MS进行定量以测定组分肽同位素物的相对 比例和因此绝对浓度。因为待定量的蛋白质或多肽随每个实验而不同，所以用于此蛋白质 或多肽的内标物必需也随每个实验而不同，并且需要对每个实验进行氨基酸分析。每个定 量需要典型地涵盖六个点的稀释曲线，其可以在一个高分辨率MS分析中通过使用以确定 比例混合的AQUAplex内标同位素物以提供标准曲线而实现。氨基酸分析的成本相对高并 且程序是费时的。每种肽序列具有特定溶解度，并且其非特异性结合常数基于可能随每个 分析而不同的各种因素而变化，所述因素例如容器材料、缓冲液、温度等。所述可变性降低 了精密度和再现性。
[0138] 相比之下，以肽作为非限制性实例，使用经修饰、优化、标记的通用报告子同位素 物混合物Uplex和一种分析物、多于一种分析物或若干串接分析物的AQUAplex本发明方法 增加了定量的分析精密度，其中内标物的品质对于确保精确定量是决定性的。仅此通用报 告子Uplex经历氨基酸分析，而非用于每种待定量的肽的内标物都需要氨基酸分析。此通 用报告子是同位素物的混合物，允许完全稀释曲线在一个MS获取中获取。通用报告子同位 素物Uplex定量因此需要仅进行一次，而非随每个实验进行，并且可以用以用标准曲线对 报告子肽进行定量。通用报告子Uplex可以经储备并且容易变得可用。在一个具体实施方 式中，将通用报告子Uplex用荧光团和/或发色团标记，并且通过测量荧光团和/或发色团 的吸光度对通用报告子Uplex进行定量，并且通过高分辨率MS测定同位素物的相对比例和 因此同位素物的绝对浓度。对于肽分析物，不需要氨基酸分析。在一个【具体实施方式】中，通 用报告子肽Uplex含有一个色氨酸，并且通过以下方式测量吸光度对通用报告子肽Uplex 进行定量：使用色氨酸的特定消光因子用高分辨率MS测定总肽浓度以测定组分同位素物 浓度。
[0139] 如图12中使用肽分析物所示，在一个【具体实施方式】中，肽A* (内标物）通过A*与 R之间的可裂解位点（例如，蛋白水解位点）与报告子肽R键联。在此实施例中，肽A*和 报告子肽R中的每一者含有至少一个用重同位素物标记的氨基酸，称为重氨基酸。当肽A* 用同位素物集合标记时，可以通过以低MS分辨率与A*内标物进行AUC比较对靶分析物进 行定量，或可以通过以高MS分辨率与A*同位素物集合进行AUC比较对靶分析物进行定量。 备选地，当报告子肽R用重同位素标记时，报告子肽R可以用同位素物集合标记，以便可以 通过与通用报告子肽U或通用报告子肽同位素物集合Uplex比较对其进行定量。因为通用 报告子肽同位素物Uplex必须具有不同质量，所以通用报告子肽Uplex可以用两种重氨基 酸或其同位素物表示，并且报告子肽R用一种重氨基酸或其同位素物表示。存在其它获得 原子质量差异的方式；例如，对于报告子肽R和通用报告子肽Uplex使用不同重氨基酸以获 得原子质量差异，在报告子肽R和通用报告子肽Uplex中使用不同同位素物，或在报告子肽 Rplex和通用报告子肽Uplex中使用多种独特同位素物。以此方式，AQUAplex同位素物的 概念可以用以改良用A*同位素物对靶肽的定量，改良用Rplex同位素物对报告子肽R的定 量，和/或改良用Uplex同位素物对报告子肽R的定量。
[0140] 肽A*具有与蛋白质型肽A相同的序列，但肽A*由于存在重氨基酸或重氨基酸同 位素物作为肽A*plex而具有不同质量。通用报告子肽Uplex是用于报告子肽R的肽标准同 位素物集合。通用报告子肽Uplex同位素物不是用以对蛋白质或多肽进行定量的内标物。 通用报告子肽Uplex具有与报告子肽R确切相同的序列，但由于并入一种或多种重氨基酸 同位素物而具有不同原子质量。
[0141] 在肽A*与报告子肽R之间的连接产生多肽，报告子肽R可以是A*的C末端，即， R-A*，或报告子肽R可以是A*的N末端，即，A*-R。A*和R中的一者或两者可以是同位素物 集合A*pIex和Rplex，其可以通过高分辨率MS分辨和定量。术语A*-R用以代表A*-R多肽 或R-A*多肽。在任一情况下，当A*是蛋白质型肽时，所得多肽中的肽A*与报告子肽R之 间必须存在可裂解（例如，蛋白水解）位点。
[0142] 将多肽同位素物集合A*plex-R与含有待定量的蛋白质或多肽P的样品混合。添 加已知量的通用报告子肽Uplex同位素物到样品中，即，将通用报告子肽Uplex加标到样品 中。用使多肽键裂解的蛋白酶（例如胰蛋白酶）消化样品。由于蛋白酶作用，多肽A*-R必 须完全消化。在一个【具体实施方式】中，在裂解（例如，蛋白水解消化）之前添加通用报告子 肽或Uplex。在一个【具体实施方式】中，在裂解（例如，蛋白水解消化）之后添加通用报告子 肽或Up lex。
[0143] 在消化之后，样品中的肽A*plex和报告子肽R的浓度是等摩尔的。也就是说，肽 A*的量等于报告子肽R的量。通用报告子肽Uplex同位素物用以使用高分辨率MS定量对 报告子肽R进行定量。肽A*plex的标准曲线用以测量样品中由蛋白质或多肽P的蛋白水 解消化产生的肽A的量。
[0144] 在使用图13和14中所示的肽的【具体实施方式】中，相同方法用于来自蛋白质P的 蛋白质型肽B和C，以便增加定量的特异性。肽B*plex具有与蛋白质型肽B相同的序列， 但由于存在重同位素物标记的氨基酸而具有不同原子质量，在低MS分辨率下，并且在高MS 分辨率下是肽B*的稀释系列。肽Oplex具有与蛋白质型肽C相同的序列，但由于存在重 同位素物标记的氨基酸而具有不同原子质量，在低MS分辨率下，并且在高MS分辨率下是肽 B*的稀释系列。
[0145] 使用肽的【具体实施方式】作为一个实例，A*pIex-R在同位素物集合A*pIex与R之 间包括裂解位点（例如，蛋白水解位点）。多肽同位素物A*plex-R因此可以用作蛋白质或 多肽P的假替代以监测单一实验中的蛋白水解消化、样品和实验中间的消化效率，并且在 一些情况下，使来自不同样品和/或不同实验的结果标准化。
[0146] 在使用肽的实例中，可以针对蛋白水解消化优化报告子肽R。作为一个实例，报 告子肽R可以经选择和/或修饰，以便其含有容易通过吸收测量而进行定量的特定氨基酸 (例如，色氨酸）。如图15中所示，报告子肽R可以含有多于一种重同位素标记的氨基酸或 单一重氨基酸的独特同位素物。此实施例通过增加相同报告子肽R序列的可能原子质量的 数目增加了所述方法的复用可能性，以便可以在单一实验中使用通用报告子肽U对多种肽 进行定量。
[0147] 在此复用【具体实施方式】中，使用本领域中已知的标准方法将报告子肽R合成得具 有不同原子质量。如图15中所示，在单一实验中分别使用重肽A*plex、B*plex和Oplex 和使用报告子肽RU R2、R3对来自蛋白质或多肽P的肽A、B和C进行定量。在图15中所 示的实施例中，报告子肽RU R2、R3以及通用报告子肽U具有相同序列但具有不同原子质 量。为了最大化可用于报告子肽R的质量组合的数目，序列可以由（但不限于）以下氨基 酸中的一者或多者组成：丙氨酸、精氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和缬 氨酸。这些氨基酸具有多4Da的质量偏移，并且可以用重同位素的不同组合进行成以制作 同位素物，如在图6-9中。蛋白质型肽（例如，A)与内标物（例如，A*)之间的最小质量差 异应超过MS分化的灵敏度阈值测定。在一个【具体实施方式】中，当4kDa是可以区别的最小 原子质量差异时，蛋白质型肽与内标物之间的最小质量差异是4kDa。在一个【具体实施方式】 中，当6mDa是可以通过高分辨率MS区别的最小原子质量差异时，内标物、报告子肽和通用 报告子同位素物之间的最小质量差异是6mDa。可以使用通用重肽U同时定量的肽的数目仅 受序列内可用的质量差异组合的数目限制。
[0148] 在使用肽的另一个实例中，报告子肽R可以经设计得具有低疏水性指数，这将增 加多肽A*plex-R的水溶性，其中肽A*plex是疏水性指数多40的同位素物的集合或其中 肽A*plex是难溶的。具有使其高度可溶的序列的报告子肽R的一个实例是PVVVPR(SEQ ID NO. 1);其疏水性指数是13. 45。具有使其高度可溶的序列的报告子肽R的一个实例是 SSAAPPPPPR(SEQ ID NO. 2)，其疏水性因子是7. 57。在一个实例中，报告子肽R和通用报告 子肽Uplex同位素物中的每一者含有用于通过吸光度测量进行定量的发色团和/或荧光 团。在通用报告子肽U和报告子肽R两者都包括发色团和/或荧光团的实施例中，通用报 告子肽Uplex同位素物可以通过测量发色团和/或荧光团的吸收并且不通过氨基酸分析进 行定量，并且同位素物可以通过高分辨率MS进行定量。通过吸光度进行蛋白质或多肽定量 的方法比氨基酸分析的方法更稳定。通过吸光度进行蛋白质或多肽定量视为比通过氨基酸 分析进行蛋白质或多肽定量更精确。发色团或荧光团的实例和评定其吸光度的方法是本领 域中已知的。
[0149] 在图14中所示的【具体实施方式】中，多肽含有三种原型肽，各自用重氨基酸标记、 与也用重同位素氨基酸标记的单报告子肽R串接，产生C*plex-B*plex-A*plex-R。使用此 多肽Oplex-B*plex_A*plex-R保证了等摩尔量的肽A*plex、B*plex和Oplex中的每一 者，并且每个同位素物集合提供了肽A、B和C的标准曲线，并且因此与使用个别肽进行定量 相比降低了定量可变性。此实施例增加了可以用相同序列作为通用报告子肽U的序列定量 的肽的数目。
[0150] 在一个【具体实施方式】中，A*plex_R或B*plex_A*plex_R或 OpIex-B*pIex-A*pIex-R可以在引入到待定量的样品中之前进行裂解。
[0151] 在使用蛋白质型肽的【具体实施方式】中，肽A*plex、B*plex、C*ple