一种人血清蛋白无机质谱联用技术的定量方法
【专利摘要】本发明公开了一种人血清蛋白无机质谱联用技术的定量方法，包括：待测样品首先进入高效液相色谱仪对血清蛋白进行分离；34S和54Fe同位素稀释剂与高效液相色谱仪的洗脱液在线混合后进入电感耦合等离子体质谱仪检测，通过硫元素对人血清中转铁蛋白、白蛋白进行绝对定量，并对转铁蛋白进行硫、铁元素共同准确定量。本发明具有操作简便、液相分离效果好、定量结果准确可靠、重现性好等优点，弥补了目前蛋白质定量技术里蛋白标准物质匮乏、蛋白定量偏差大的不足，填补了目前国内无机质谱技术对基体样品中混合蛋白同时、多方式绝对定量方法的空白，为不同基体样品中含硫蛋白及金属蛋白的绝对定量提供了新的思路和手段。
【专利说明】一种人血清蛋白无机质谱联用技术的定量方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及蛋白质定量分析领域，更进一步说，涉及一种人血清蛋白无机质谱联用技术的定量方法。
【背景技术】
[0002]人血清中转铁蛋白及白蛋白的浓度水平与一些疾病息息相关，如血清转铁蛋白浓度在机体受到急性或慢性感染时降低，而在缺铁性贫血和妊娠末期，转铁蛋白含量增高。血清白蛋白的浓度可以反映肝脏是否受损及受损的严重程度，同时白蛋白浓度水平的改变还能引起一系列的病理性继发症。因此对人血清中转铁蛋白及白蛋白的定量分析研究是探索疾病发生发展状况的重要手段。
[0003]目前蛋白质定量技术中比较成熟的方法多是基于同位素标记的生物质谱(如电喷雾电离质谱、基质辅助激光解吸质谱)分析技术，但是生物质谱的信号响应与蛋白质含量关系复杂，需要已知丰度的纯蛋白进行归一化处理，才能对蛋白质定量。然而，由于蛋白质种类繁多，并不是所有蛋白都有商品化产品，必须花费很长时间纯化、制备各种纯蛋白。不同与生物质谱，电感耦合等离子质谱(ICP-MS)是一种“硬”电离模式，样品被等离子体的高温(6000?10000K)尚子化成正尚子并在真空系统中按照质荷比分尚，信号响应与原子所处的分子环境无关，特别适合复杂体系中痕量或微量元素的定量。
[0004]利用ICP-MS联用技术对蛋白质中的元素定量，是近年来蛋白质定量技术研究的热点。其中高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(HPLC-1CP-MS)联用定量蛋白质的研究较多，而且为保证定量的准确性，需要使用与待测蛋白匹配的标准物质保障质控和量传，然而目前可获得的纯蛋白十分有限，常采用hplc-1cp-ms结合同位素稀释法来解决这一难题。同位素稀释法(ID)主要分为特异性形态及非特异性形态。前者的稀释剂在前处理过程中加入到待测样品里，定量结果不受实验过程中样品损失、形态变化、仪器漂移等因素影响，但是必须制备出与待测样品匹配的特异性稀释剂，直到2005年才第一次应用到蛋白质的绝对定量。非特异性形态同位素稀释法(也称柱后同位素稀释法)，稀释剂为某元素的浓缩同位素，基本都有商品化的产品，可实现不同基体蛋白质的定量分析。
[0005]大部分蛋白质中均含有甲硫氨酸、半胱氨酸等含硫氨基酸，因此硫(S)是最适合作为蛋白质定量分析的元素。ICP-MS测定出蛋白质中硫的含量，再根据蛋白质氨基酸序列确定的硫原子个数，就可以对蛋白质进行定量分析。但是，目前报道的ICP-MS测量硫最大的难题是16O2+等对硫的谱线干扰，需要使用碰撞/反应池技术或高分辨质谱来解决，因此通过测定硫来定量的蛋白质主要是纯蛋白，涉及到基体蛋白质定量的还很少。而且高效液相色谱-柱后同位素稀释质谱法(HPLC-1D-1CP-MS)对基体蛋白质的定量分析大部分通过测定金属元素，如Fe、Cu、Zn、Sn等进行，还未见到硫、铁共同定量转铁蛋白的比较以及基体样品人血清里转铁蛋白、白蛋白通过硫元素的同时定量分析。
【发明内容】
[0006]为解决现有技术中出现的问题，本发明提供了一种人血清蛋白无机质谱联用技术的定量方法。通过强阴离子交换高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱同位素稀释法(HPLC-1D-1CP-MS)绝对定量人血清中混合蛋白的方法。本发明具有操作简便、液相分离效果好、定量结果准确可靠、重现性好等优点，弥补了目前蛋白质定量技术里蛋白标准物质匮乏的不足，适用于不同基体样品中含硫蛋白及金属蛋白的绝对定量。
[0007]本发明的目的是提供一种人血清蛋白无机质谱联用技术的定量方法。
[0008]包括:
[0009]待测样品首先进入高效液相色谱仪对血清蛋白进行分离；34S和54Fe同位素稀释剂与高效液相色谱仪的洗脱液在线混合后进入电感耦合等离子体质谱仪检测，通过硫元素对人血清中转铁蛋白、白蛋白进行绝对定量，并对转铁蛋白进行硫、铁元素共同准确定量。
[0010]具体步骤包括:
[0011](I)待测样品的前处理过程:包括人血清标准物质的重构及血清样品的富集；
[0012](2)样品检测:待测样品进样进入高效液相色谱仪进行测定，对血清蛋白进行分离；34S和54Fe同位素稀释剂通过泵加入，与高效液相色谱仪的洗脱液在线混合后进入电感耦合等离子体质谱仪检测；
[0013](3)定量计算:将整个色谱分离过程中质谱得到的同位素比值谱图转化为质量流谱图，积分相应蛋白质的峰面积可得到元素的绝对含量，结合液相进样体积及蛋白质所含元素个数，计算出蛋白质的绝对浓度。
[0014]其中，
[0015]34S和54Fe同位素稀释剂流速在高效液相色谱仪洗脱待测样品的O?15min为
0.01?0.05mL/min,在15?30min流速增加到0.08?0.30mL/min ；34S同位素稀释剂浓度为2?8 μ g/g, 54Fe同位素稀释剂浓度为0.1?0.6 μ g/g。
[0016]高效液相色谱条件:流动相A 为 20mmol/Kg Tris-HCl (pH8.6), B 为 A+500mmol/Kg甲酸铵溶液，使用前经过0.22 μ m有机相微孔滤膜过滤；流速0.6?1.0mL/min,时间程序为30min里B相由0%增加到100% ;进样体积10 μ L，自动进样；紫外检测器检测波长为280nm ；
[0017]电感耦合等离子体质谱仪条件:功率1200?1300W，样品气流速1.0O?1.50L/min,辅助气流速0.80?1.20L/min,冷却气流速15?17L/min，分辨率m/ Δ m=4000,扫描次数 700X1。
[0018]本发明具体可采用以下技术方案:
[0019]I)、HPLC-1D-1CP-MS 联用系统:
[0020]液相色谱仪HPLC:日本Shimadzu公司液相色谱系统，含LC-30AD高压液相泵，SIL-30AC自动进样器，CT0-20A柱温箱，SPD-20A紫外检测器。采用Shodex QA-825IEC(8.0mmX75mm)强阴离子交换柱为色谱柱。
[0021]同位素稀释法ID:同位素稀释剂34S、54Fe混合溶液由液相泵LC-20AD加入，与液相色谱的洗脱液经过三通混合后在线进入ICP-MS检测。
[0022]电感I禹合等离子体质谱仪ICP-MS:美国Thermo Fisher Scientific公司Element2扇形磁场电感稱合等离子质谱仪,配置低(m/ Am=300)、中(m/ Δm=4000)、高(m/Am=IOOOO) 3种固定分辨率，配有进样系统，射频发生器，等离子体系统，离子透镜系统，真空系统，检测器，气路控制系统。
[0023]2)、配制所需试剂:
[0024](I )、配置 25mmol/Kg Tris-HAc 缓冲液，500mmol/Kg Na2CO3溶液，IOmmoI/Kg FeCl3溶液。
[0025](2)、流动相:A 相:20mmol/Kg Tris-HCl (ρΗ8.6) ;B 相:A+500mmol/Kg 甲酸铵溶液，使用前经过0.22 μ m有机相微孔滤膜过滤。所有的试剂均是优级纯，实验用水均为超纯水。
[0026]3)、人血清标准物质及样品的前处理过程:可采用本领域通常的前处理过程，本发明中，可优选按以下进行前处理:
[0027](I)、人血清标准物质的重构:从冰箱中取出样品瓶，室温放置lh。在桌面上轻击样品瓶底部，确保所有样品均在样品瓶底部，移去螺栓帽。连同橡胶塞一同称重并清零，小心提升橡胶塞直到空气进入其中，通过橡胶塞的凹槽用移液枪小心加入ImL超纯水，将橡胶塞放回原位，称重m=l.0185go室温下放置Ih,接下来的Ih中小心倒置至少5次(不能摇动)，室温下过夜。使用当天，Ih里至少倒置5次。
[0028](2)、人血清标准物质及样品的富集处理:人血清蛋白标准物质、人血清样品按下面方法富集处理，即 300 μ L25mmol/Kg Tris-HAc 缓冲液中加入 5 μ L500mmol/Kg Na2CO3,
5μ L I Ommo I/Kg FeCljP 100 μ L重构的血清标准品及血清样品，得到的样品溶液室温下孵育2h，备用。
[0029]4)、实验所用的仪器条件:
[0030](I)、高效液相色谱条件:流动相A为20mmol/Kg Tris-HCl (pH8.6), B为A+500mmol/Kg甲酸铵溶液，使用前经过0.22 μ m有机相微孔滤膜过滤。流速0.7mL/min,时间程序为30min里B相由0%增加到100%;进样体积10 μ L，自动进样；紫外检测器检测波长为 280nm。
[0031](2)、柱后同位素稀释条件:34S和54Fe同位素稀释剂通过液相系统自带的LC-20AD泵加入，与液相色谱的洗脱液经过三通混合后在线进入ICP-MS检测。
[0032](3)、电感耦合等离子体质谱仪条件:功率1200~1300W，样品气流速1.00~
1.50L/min,辅助气流速0.80~1.20L/min,冷却气流速15~17L/min，分辨率m/ Δ m=4000,扫描次数700X1。
[0033]5)、样品检测与定量计算:
[0034](I)、样品检测:开机待高效液相色谱仪、电感耦合等离子体质谱仪稳定后，先用lng/g的Be、In、Bi调谐液对ICP-MS进行调谐，然后用Φ=0.13mm的PEEK管及三通连接液相色谱仪、稀释剂加入泵和电感耦合等离子体质谱仪。在上述HPLC-1D-1CP-MS仪器参数条件下采用自动进样器进样10 μ L进行测定，HPLC对血清蛋白进行分离，ICP-MS在线对混合溶液中32S、34S、54Fe及56Fe进行检测。
[0035](2)、定量计算:将整个色谱分离过程中质谱得到的同位素比值谱图，根据下面的同位素稀释公式，转化为元素的质量流(Mass Flow)谱图。
【权利要求】
1.一种人血清蛋白无机质谱联用技术的定量方法，其特征在于所述方法包括: 待测样品首先进入高效液相色谱仪对血清蛋白进行分离；34s和54Fe同位素稀释剂与高效液相色谱仪的洗脱液在线混合后进入电感耦合等离子体质谱仪检测，通过硫元素对人血清中转铁蛋白、白蛋白进行绝对定量，并对转铁蛋白进行硫、铁元素共同准确定量。
2.如权利要求1所述的人血清蛋白无机质谱联用技术的定量方法，其特征在于所述方法包括: (1)待测样品的前处理过程:包括人血清标准物质的重构及血清样品的富集； (2)样品检测:待测样品进样进入高效液相色谱仪进行测定，对血清蛋白进行分离；34S和54Fe同位素稀释剂通过泵加入，与高效液相色谱仪的洗脱液在线混合后进入电感耦合等离子体质谱仪检测； (3)定量计算:将整个色谱分离过程中质谱得到的同位素比值谱图转化为质量流谱图，积分相应蛋白质的峰面积可得到元素的绝对含量，结合液相进样体积及蛋白质所含元素个数，计算出蛋白质的绝对浓度。
3.如权利要求2所述的人血清蛋白无机质谱联用技术的定量方法，其特征在于: 34S和54Fe同位素稀释剂流速在高效液相色谱仪洗脱待测样品的O?15min为0.0l?0.05mL/min,在 15 ?30min 流速增加到 0.08 ?0.30mL/min ； 34S同位素稀释剂浓度为2?8μ g/g,54Fe同位素稀释剂浓度为0.1?0.6μ g/g。
4.如权利要求3所述的人血清蛋白无机质谱联用技术的定量方法，其特征在于: 高效液相色谱条件:流动相A为20mmol/Kg Tris-HCl (pH8.6), B为A+500mmol/Kg甲酸铵溶液，使用前经过0.22 μ m有机相微孔滤膜过滤；流速0.6?1.0mL/min,时间程序为30min里B相由0%增加到100% ;进样体积10 μ L，自动进样；紫外检测器检测波长为280nm ；电感耦合等离子体质谱仪条件:功率1200?1300W，样品气流速1.00?1.50L/min,辅助气流速0.80?1.20L/min，冷却气流速15?17L/min，分辨率m/Λ m=4000 ;扫描次数700X1。
【文档编号】G01N30/88GK103792315SQ201410031739
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月23日 优先权日:2014年1月23日
【发明者】冯流星, 张丹, 王军, 熊金平 申请人:中国计量科学研究院