一种水环境中十种雌激素的共检测技术的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种同时检测水环境中十种雌激素的技术。通过固相萃取技术对水样进行前处理后，使用液相色谱串联质谱仪检测其含量。本方法将采集后的水样通过微孔滤膜除去水中悬浮的杂质颗粒，并通过固相萃取装置将水样中的雌激素浓缩富集到固相萃取柱上，然后用乙酸乙酯将富集在固相萃取柱的雌激素洗脱下来，用氮气吹干，定容，最后用液相色谱串联质谱仪检测雌激素的含量。该方法操作简便，回收率较高，耗时低，能同时检测较多种类的雌激素。
【专利说明】一种水环境中十种雌激素的共检测技术
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种运用液相色谱串联质谱仪同时测定水环境中雌酮，17 β -雌二醇，雌三醇，乙炔雌二醇，壬基酚，辛基酚，戊酸雌二醇，己烷雌酚，己烯雌酚，双酚A等十种雌激素的方法。
【背景技术】
[0002]环境雌激素是一种外源性物质，能够模拟和干扰人或动物体内雌激素的正常合成、运输、结合等过程，能对机体的生殖系统，免疫系统和生殖系统造成影响。环境中存在的雌激素主要包括天然雌激素如雌酮(Estrone, El), 17 β -雌二醇(17 β-Estradiol, E2)和雌三醇(Estriol, E3)以及人工合成雌激素如乙炔雌二醇(17 a-Ethynylestradiol, EE2),壬基酌'(^1-n-Nonylphenol, NP),辛基酌.(4-tert_0ctylphenol, 0P),戍酸雌二醇(17-beta-Estradiol 17-valerate, EV),己烯雌酌'(Diethylstibestrol, DES),己烧雌酌.(Hexestrol, HEX),双酹A (Bisphenol A)等,种类丰富。人和动物的每天都会排出天然雌激素，据报道，成年男性每天排出雌酮5 μ g，而女性每天排出的17 β-雌二醇和雌酮分别为2-12 μ g和3-20 μ g。人工合成雌激素如乙炔雌二醇被用作避孕药被大量使用，当被排入水体中也会对水体造成影响。研究表明，即使在极低的浓度，这些雌激素也会对水体中的鱼类等生物产生性别干扰，如雄鱼雌性化，并会引起人类的疾病。
[0003]近年来雌激素引起水体中鱼类雌性化的现象越来越引起人们的关注，而采用现代的检测技术来对水体的痕量雌激素的检测显得尤为重要。检测雌激素的方法有很多，但能同时检出的雌激素种类还较少 。主流检测手段有气相色谱(GC)和液相色谱(LC)，特别是它们与质谱联用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)与气相色谱(GC/MS)相比，无需衍生化，耗时少。建立重现性好，回收率和灵敏度高，多种雌激素同时检出的检测方法十分重要。
【发明内容】
[0004]本发明是针对自然水体中的雌激素的含量，拟开发一种回收率高，快速，准确地同时测量雌酮，17 β -雌二醇，雌三醇，乙炔雌二醇，壬基酚，辛基酚，戊酸雌二醇，己烷雌酚，己烯雌酚，双酚A等十种雌激素的技术。
[0005]本发明的技术方案如下:
一种同时测量雌酮，17 β -雌二醇，雌三醇，乙炔雌二醇，壬基酚，辛基酚，戊酸雌二醇，己烷雌酚，己烯雌酚，双酚A十种雌激素法定方法，该方法的步骤如下步骤:
(I)水样前处理
将采集的水样用0.45 ym孔径的滤膜过滤并将pH值调至3.0。量取1.0 L的水样，用Waters公司的C18 (6 mL, 200 mg)固相萃取小柱对水样进行富集,速度控制在10ml/min。固相萃取小柱使用前进行活化，条件为，先后用6 mL乙酸乙酯，6mL甲醇和6 mL pH=3的盐酸水溶液预处理。待富集结束后，用6mL 10%(v/v)的甲醇水溶液洗柱去除其它杂质，然后抽真空干燥20 min以去除水分。干燥后，用6 mL的乙酸乙酯将目标化合物洗脱至氮吹管中，用温和的氮气流将其吹干。将样品转移至样品瓶中并保存在4°C的冰箱中待测；
(2)使用液相色谱串联质谱仪检测雌激素浓度
色谱柱:Therm。Accucore C18, 100 X 2.1mm,粒径 2.6 μ m ;
流动相及梯度洗脱条件:流动相为0.5%的氨水(流动相A)和纯甲醇(流动相B)，梯度洗脱条件为，流动相B的比例在前2min内保持在20%，2_8min内从20%升到60%，8_13min内从 60% 继续增加到 90%, 13-16min 内维持在 90%, 16-16.1min 从 90% 降至 20%, 16.l_20min内维持在20%不变；
(3)标准曲线的绘制，以外标法绘制标准曲线；
(4)样品含量的测定:
将采集的水样按照1)的方法进行前处理，按照2)所述的条件进行雌激素的测定，并用3)中的方法计算雌激素的含量。
[0006]本发明所述的方法还包括采用Mill1-Q超纯水，添加浓度为200 μ g/L，500 μ g/L的十种目标混合标样，安装(4)所述的含量测定方法，测定各雌激素的浓度。
[0007]本发明所述的雌激素为雌酮，17 β -雌二醇，雌三醇，乙炔雌二醇，壬基酚，辛基酚，戊酸雌二醇，己烷雌酚，己烯雌酚，双酚Α。
[0008]本发明的有益效果是运用固相萃取技术所需的有机溶剂较少，减少对环境的污染，并且富集倍数高，所用的液相色谱串联质谱仪灵敏度高，操作简便，检测限低，与气相色谱相比更节约时间。本发明提供一种回收率高，重现性好，灵敏度高的共检测方法，能同时测定较多种(十种)雌激素的含量。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1 为 100 μ g/L 标样的谱图，出峰顺序为 EE2:10.06min, NP:14.58min, OP:13.07min, EV:14.20min, HEX: 10.53min, E3:6.46min, DES:9.79min, BPA:8.44min，El:9.92min, E2:9.90mino
图2为100 μ g/L的NP的标样的谱图，出峰时间为14.58min。
图3为100 μ g/L的OP的标样的谱图，出峰时间为13.07min。
图4为100 μ g/L的EV的标样的谱图，出峰时间为14.20min。
图5为100 μ g/L的HEX的标样的谱图，出峰时间为10.53min。
图6为100 μ g/L的E3的标样的谱图，出峰时间为6.46min。
图7为100 μ g/L的DES的标样的谱图，出峰时间为9.79min。
图8为100 μ g/L的BPA的标样的谱图，出峰时间为8.44min。
图9为100 μ g/L的El的标样的谱图，出峰时间为9.92min。
图10为100 μ g/L的E2的标样的谱图，出峰时间为9.90min。
【具体实施方式】
[0010]下面结合实例和附图对本发明做进一步的描述:
(I)水样前处理
将采集的水样用0.45 ym孔径的滤膜过滤并将pH值调至3.0。量取1.0 L的水样，用Waters公司的C18 (6 mL, 200 mg)固相萃取小柱对水样进行富集,速度控制在10ml/min。固相萃取小柱使用前进行活化，条件为先后用6 mL乙酸乙酯，6mL甲醇和6 mL pH=3的盐酸水溶液预处理。待富集结束后，用6mL 10%(v/v)的甲醇水溶液洗柱去除其它杂质，然后抽真空干燥20 min以去除水分。干燥后，用6 mL的乙酸乙酯将目标化合物洗脱至氮吹管中，用温和的氮气流将其吹干。将样品转移至样品瓶中并保存在4°C的冰箱中待测；
(2)使用液相色谱串联质谱仪检测雌激素浓度:
液相色谱串联质谱仪的条件:液相为岛津LC-20A，带自动进样器，日本岛津公司，质谱仪为AB的3200QTRAP线性离子阱质谱仪，带电喷雾离子源(ESI)，美国Applied Biosystem公司；
色谱柱:Thermo Accucore C18, 100X 2.1mm,粒径2.6 μ m。离子源:电喷雾离子源(ESI)，检测模式:负离子检测模式，离子喷雾电压:-4500V，温度:450°C，离子源气体I压力为35psi,离子源气体2压力为40psi,气帘气体(N2)压力为12psi,碰撞气(N2)压力:High。流动相采用纯甲醇和0.5%氨水，梯度洗脱条件如表1 ;
通过液相色谱串联质谱仪所测得的的雌酮，17 β -雌二醇，雌三醇，乙炔雌二醇，壬基酚，辛基酚，戊酸雌二醇，己烷雌酚，己烯雌酚，双酚A的定量限分别为0.4 μ g/L, 8 μ g/L,8 μ g/L, 8 μ g/L, 2 μ g/L, 4 μ g/L, 8 μ g/L, 0.8 μ g/L, 0.8 μ g/L 和 8 μ g/L ；
表1流动相洗脱条件；
【权利要求】
1.一种水环境中同时测定十种雌激素的方法，包含以下十种:雌酮，17 β -雌二醇，雌三醇，乙炔雌二醇，壬基酚，辛基酚，戊酸雌二醇，己烷雌酚，己烯雌酚，双酚Α。
2.该十种雌激素共检测方法包含以下步骤: (1)水样前处理 将采集的水样用0.45 μ m孔径的滤膜过滤并将pH调值至3.0，量取1.0 L的水样，用Waters公司的C18 (6 mL, 200 mg)固相萃取小柱对水样进行富集,速度控制在10ml/min,固相萃取小柱使用前进行活化，条件为先后用6 mL乙酸乙酯，6mL甲醇和6 mL pH=3的盐酸水溶液预处理，待富集结束后，用6mL 10%(v/v)的甲醇水溶液洗柱去除其它杂质，然后抽真空干燥20 min以去除水分，干燥后，用6 mL的乙酸乙酯将目标化合物洗脱至氮吹管中，用温和的氮气流将其吹干，将样品转移至样品瓶中并保存在4°C的冰箱中待测； (2)使用液相色谱串联质谱仪检测雌激素浓度:
色谱柱:Therm。Accucore C18, 100 X 2.1mm,粒径 2.6 μ m ; 流动相及梯度洗脱条件:流动相为0.5%的氨水(流动相A)和纯甲醇(流动相B)，梯度洗脱条件为，流动相B的比例在前2min内保持在20%，2_8min内从20%升到60%，8_13min内从 60% 继续增加到 90%, 13-16min 内维持在 90%, 16-16.1min 从 90% 降至 20%, 16.l_20min内维持在20%不变 ； (3)标准曲线的绘制 以外标法绘制标准曲线； (4)样品含量的测定 将采集的水样按照I)的方法进行前处理，按照2)所述的条件进行雌激素的测定，并用3)中的方法计算雌激素的含量。
【文档编号】G01N30/88GK103792314SQ201410031449
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月23日 优先权日:2014年1月23日
【发明者】罗专溪, 王大鹏, 张娴, 颜昌宙, 林立峰 申请人:中国科学院城市环境研究所