一种土壤重金属污染程度评价方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种评价受污染上壤中的重金属污染程度的方法，属于环境健康遗传 毒理学领域。
【背景技术】
[0002] ±壤圈是联系大气圈、水圈、岩石圈和生物圈的重要纽带，是人类农业生产的基 地、陆地生态系统的基础，通过与其他圈层的物质循环、能量交换，影响±壤的全球变化W 及生物活性、多样性和生产性，是与人类关系最密切的一种环境要素。然而，由于人口急剧 增长，工业迅猛发展，固体废物不断向±壤表面堆放和倾倒，有害废水不断向±壤中渗透， 大气中的有害气体及飘尘也不断随雨水降落在±壤中，导致了±壤污染。
[0003] 污染物进入±壤后，在±壤体系中发生一系列的氧化、还原、沉降、溶解、迁移、转 化等复杂的物理化学过程，并通过生物的新陈代谢活动使之进一步富集和放大，破坏±壤 圈的生态平衡，并对人类健康产生了潜在的风险。但是由于±壤污染被称为"看不见的污 染"，往往很难被察觉，因此，±壤成为了各种有毒有害物质的"大本营"，加大了污染预防、 控制和治理的难度。
[0004] ±壤污染中的重金属污染物（诸如As、Cd等）具有致癌、致崎、致突变作用，可通 过食物链进一步富集和放大，对人体健康及生态系统具有潜在的危害作用。 阳〇化]重金属污染物在±壤中移动性很小，不易随水淋滤，不为微生物降解，通过食物链 进入人体后，易于生物富集和生物放大，潜在危害极大。伴随着工业化和城市化进程，±壤 重金属污染也成为±壤中长期存在的"毒瘤"，我国±壤重金属污染形势十分严峻。
[0006] 农业部对我国24个省（市）的320个重点污染区进行了环境监测，调查数据显 示，污染超标的种植面积占监测总面积的20%，达到了 60. 6万hm2,其中重金属超标的种植 面积贡献率在80%W上，儒、铜、隶、铅几种典型重金属及其复合污染最为突出。中国工程院 ±罗锡文表示，占全国农田总数的1/6的耕地正在受到重金属的威胁，而广东省未受重金 属污染的耕地比例仅占11%。
[0007] 当前我国±壤重金属污染恶化现象严重，已进入一个"集中多发期"，严重制约着 经济和农业的可持续发展。
[0008] 微核试验技术是一种某些理化因素诱使染色体断裂，且断裂的染色体不能自行恢 复，从而形成额外核小体等为测试终点的诊断方法。蚕豆根尖的微核试验是T細siuMa于 1982年建立的，具有操作简便、剂量-效应关系明显、快速、准确等优点，因而运项技术在国 内外得到了广泛的应用。根据目前的研究表明，蚕豆根尖微核率、染色体崎变率与生物碱、 抗生素、福射等目标污染物的毒性具有较好的相关性，但是还不了解其与重金属污染物之 间的相关性如何。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于提出一种有效的评价±壤重金属污染程度，从而为当地开展污 染防治提供有效指导的方法。
[0010] 具体来说，本发明采用W下技术方案：
[0011] 一种±壤重金属污染程度评价方法，其特征在于，所述方法包括W下步骤：
[0012] 1) ±壤浸出液的提取：采集±样过筛，与提取溶剂混合后，振荡，离屯、，得到±样 的浸出液；
[0013] 2)浸种和催芽：取大小均匀、粒大饱满的健康的松滋青皮蚕豆种子放入盛有水的 烧杯中，于恒溫箱中，在黑暗下浸泡，待种子吸水膨胀后，用纱布裹置于底层铺满脱脂棉的 磁盘中，保持溫度和湿度，于黑暗环境下继续催芽，至初生根长至2-3cm;
[0014] 3)致突变处理：选取初生根生长良好且根长一致的种子放入装有步骤1)中所得 ±壤浸出液的培养皿中，放入培养箱中进行致突变处理，同时W蒸馈水做阴性对照；
[0015] 4)根尖恢复培养：将处理后的种子，用水浸洗，然后把洗净的种子再放入湿脱脂 棉盘中，在培养条件下恢复培养22-2地，中途1化换水1次；
[0016] 5)固定和保存：将恢复后的种子，从根尖顶端切下1cm长幼根放入对应编号的小 瓶中，加卡诺氏液固定，清洗根尖，用吸水纸吸净水分，浸入70%乙醇中置于4°C冰箱保存 备用；
[0017] 6)解离和染色：取固定好的根尖，用蒸馈水浸洗，吸净残水后，用盐酸水解处理， 在黑暗环境用下孚尔根溶液染色，染色完毕后，依次用S〇2洗涂液和蒸馈水清洗；
[0018] 7)压片和镜检：常规压片，计算根尖细胞中的微核数，每个根尖随机计数1000个 细胞中的微核数；
[0019] 8)统计分析：按如下公式计算微核率MSN:
[0020] MSN%。=某测试点观察到的MSN数/某测试点观察到的细胞数；
[0021] 9)计算污染指数：按如下公式计算污染指数PI: 阳02引 PI=处理组MSN%。平均值/对照组MSN%。平均值。
[0023] 在步骤9中，PI在（0,1.引区间的确定为基本无污染，PI在（1. 5, 2]区间的确定 为轻度污染，PI在（2,3. 5]区间的确定为中度污染，PI在3. 5W上的确定为重度污染。
[0024] 优选地，步骤1) ±壤浸出液的提取进一步包括：±样过840ym尼龙筛，提取溶 剂为O.Olmol/L化〇2，±液混合质量比为1:10,机械振荡化，然后在3000g速率下离屯、 20min。
[00巧]作为优选方案，步骤2)浸种和催芽进一步包括：将所述蚕豆种子放入盛有蒸馈水 的烧杯中，置于25°C恒溫箱，在黑暗下浸泡26-3化，此间至少换水两次，其中浸泡和更换用 的蒸馈水事先放在恒溫箱预溫。
[00%] 进一步，步骤3)致突变处理进一步包括：每个装有±壤浸出液的培养皿中放置 6-8粒种子，在培养箱中进行致突变处理6-化。
[0027] 在优选方案中，步骤4)根尖恢复培养进一步包括：处理后的种子用自来水或蒸馈 水浸洗3次，每次2-3min，然后把洗净的种子再放入湿脱脂棉盘中，25°C恢复培养22-2地， 中途1化换水1次。
[002引在步骤5)固定和保存中，所用的卡诺氏液为按质量比无水酒精：冰醋酸=3 : 1 的混合溶液。
[0029] 进一步，步骤6)解离和染色进一步包括：固定好的根尖用蒸馈水浸洗2次，每次 5min，吸净残水后，用5mol/L的盐酸在28°C下水解10-25min处理40min，在黑暗的环境用 下孚尔根溶液染色，染色完毕后，依次用S〇2洗涂液和蒸馈水清洗。
[0030] 有益效果：±壤重金属污染会对农作物的生产造成很大影响，例如报道披露，全国 每年生产的"儒米"达到数亿公斤。另外，植物根系与±壤与极大的接触面，在植物与±壤之 间进行了频繁的物质交换，彼此有着强烈影响，±壤污染直接影响作物的正常生长和产量， 降低作物对±壤有害病菌、虫体危害的抵抗性。本发明采用蚕豆作为指示生物检测±壤重 金属污染物的遗传毒性，与当前采用藻类细胞作为指示生物的检测方法W及化学法相比， 更能真实反映重金属污染对当地环境的影响。另外，本发明也验证了采用蚕豆根尖微核率 作为复合重金属污染程度指标的可靠性，是一种有效且便利的评价方法。
【具体实施方式】
[0031] 为了验证蚕豆根尖微核试验与重金属复合污染程度之间的相关性，我们设计了实 验。 阳0巧 1.样品采集
[0033] 经过实地考察、调研，在综合考虑研究区内地貌、±壤类型、±壤用途等自然条件， W及各种人为因素的基础上，我们形成在南京工业区布设采样点的方案，于2011年4月，由 近及远呈福射状，设定采样点，在每个采样点，采集0-20cm深度的表层±壤样品。每个样品 在采集过程中，都用GI^S精确定位，并考察了各个采样点附近的环境条件、地理状况。去除 ±壤混合样中植物残体、石头等，放在阴凉、通风处自然风干。采样点编号、经缔度见表1。
[0034] 表1采样点编号及经缔度
[0035]
[0036] 2.样品分析
[0037] ±壤重金属含量，采用EPA规范的方法（METHOD3050B)消解，ICP-0ES(Optima 5300DV)测定。
[00測 由表2可见，重金属含量在±样之间，存在很大的变异性，南京市±壤已经受到人 为活动的干扰和影响。综合各采样点，±壤不同重金属的含量分布来看，±壤中的重金属Ba和Mn的含量均值显著高于其他重金属含量（P<0. 005)。不同的采样点相比较，南京钢厂± 壤中，S1、S2、S3、S4采样点，除个别重金属（比如Co)含量低于个别采样点之外，绝大多数 重金属含量显著高于其他采样点（P<0. 05)。W江苏省南京地区各元素背景值作为评价标 准，采样点组W南钢为中屯、，福射状布设了 12个采样点，4个采样点的化含量低于背景值， 但其余所有功能区，±壤重金属化含量全部超过背景值，其中南钢的=个采样点S1、S2和 S3,分别是背景值的3. 194、14. 484和3. 261倍。所有的±壤样品，Co和化的含量均超过 背景值，其中南钢的=个采样点S1、S2和S3 ±壤中的化，分别是背景值的4. 200、2. 791和 4. 899倍，南钢的=个采样点S1、S2和S3 ±壤中化超标率分别为695. 016%、1487. 331% 和454. 258%，化的含量比背景值高出了 1075. 322%、2151. 255%和791. 723%。国家±壤 环境质量二级标准值，是为保障农业生产、维护人体健康的±壤限制值（GB15618-1995)。在 所采集的上壤样品中，有5%的±壤化、14%的±壤化、17%的±壤Ni和18%±壤化超过 国家二级标准值。所有采样点仅有一个点位化的含量，超过国家二级标准值，但是有32% 的±壤化含量，超过国家一级标准值，南钢重金属污染最为严重。根据重金属污染指数模 型（表2. 7)，南钢S2采样点的重金属化Xu、Zn、Ni总量的平均值，分别是±壤环境质量二 级标准值的1. 125、4. 664、2. 651、1.