一种用于测定中兽药散剂中11种非法添加药物含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于测定中兽药散剂中11种非法添加药物含量的方法。
【背景技术】
[0002] 中兽药具有毒副作用相对较小、在动物源性食品中无残留或残留量少和不易产生 耐药性等优点，其产品日益受到畜禽养殖者的重视，许多畜禽养殖企业已将中兽药作为预 防、治疗疾病及促进动物生长的重点使用对象。目前一些不法分子利用兽药监管中存在的 漏洞，通过非法添加疗效确定且使用广泛的化学药物，使疗效缓和的中兽药具有速效等优 点，这些化学成分通过食物链传递，最终对人体健康产生严重危害，中兽药中非法添加化学 药物的检测逐渐受到人们的重视。
[0003] 关于中兽药中非法添加药物的检测方法，目前有薄层色谱法、红外光谱法、毛细管 电泳法、原子吸收法、液相色谱法等，但上述方法存在操作繁琐，灵敏度低或准确性差等问 题。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种用于测定中兽药散剂中11 种非法添加药物含量的方法。
[0005] 为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：
[0006] -种用于测定中兽药散剂中11种非法添加药物含量的方法，包括以下步骤：
[0007] (1)采用有机溶剂超声提取方法对待测中兽药散剂进行预处理，有机溶剂为甲 醇-水，甲醇和水的体积比为〇. 9-1. 1:0. 9-1. 1 ;
[0008] (2)通过液相色谱-串联质谱法对提取液中的喹乙醇、利巴韦林、金刚烷胺、金刚 乙胺、地塞米松、氯霉素、己烯雌酚、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林和呋喃唑酮进行检测。
[0009] 优选的，所述甲醇-水中，甲醇和水的体积为1:1。
[0010] 以甲醇/水（1:1)作为提取试剂超声提取，过滤膜后即可上机检测，预处理简单易 于操作，且回收率良好。虽然利用有机溶剂进行提取有机物质是公知常识，但是，不同的有 机溶剂的提取效果不同，且有些有机溶剂会对后续的检测产生干扰。经过反复试验发现，大 部分常用的有机溶剂都不能对这11种物质进行有效提取，或对后续的检测产生较大干扰， 即得到的回收率普遍较小，且检测的谱图杂峰较多，不能精确反应待测物质的含量。本发明 中选用体积比为1 :1左右的甲醇-水作为提取液，对这11中非法添加物质都能进行很有效 地提取，且不会对后续检测造成干扰，而甲醇的比例过大或过小都不能取得好的效果。
[0011] 虽然有些有些地方会用到甲醇/水作为提取剂，但是待提取的对象不同，如，动植 物组织中的相关物质的提取。虽然甲醇提取有机物是利用相似相溶的原理，甲醇/水的量 足够多时，可以将待提取对象中的相关物质提取完全，但是，仍旧存在如下问题：待提取对 象的不同，会导致提取到甲醇/水中的物质的种类及含量不同，无法保证提取的这些物质 中不会存在干扰物质，或将待测物质屏蔽，或与待测物质产生相同的实验结果，或不能与待 测物质完全分离产生干扰，进而使实验结果偏大或偏小，这些都是不可预期的，所以，本发 明选择提取剂时，是大范围实验，不断排除，大部分的有机溶剂都不能产生令人满意的实验 结果，而最后选择甲醇和水的体积比为1:1的甲醇/水也是不经意的一个发现，该甲醇/水 不仅使实验结果令人满意，还大大提高了实验结果的重现性，所以该处的甲醇/水存在意 料不到的技术效果。
[0012] 优选的，步骤⑴中，所述中兽药散剂和甲醇-水的比例为（0.4-0.6)g: (4. 5-5. 5)ml。试验证明，当中兽药散剂和甲醇-水为以上比例时，能更有效利用甲醇-水， 保证有效提取的同时，防止了甲醇-水的浪费。
[0013] 优选的，步骤（1)中，所述超声时间为15-45min，优选为30min ;超声的温度为 25-35 °C，优选为 30 °C。
[0014] 优选的，步骤（1)中，将超声提取后的溶液进行过滤，有机滤膜的孔径为0.22或 0? 45 y m，优选 0? 22 y m。
[0015] 超声波提取是利用超声波具有的机械效应，空化效应和热效应，通过增大介质分 子的运动速度、增大介质的穿透力以提取生物有效成分。利用超声波技术来强化提取分离 过程，可有效提高提取分离率，缩短提取时间、节约成本。上述超声条件经过实验验证使提 取分离率最高。经过实验分析，所述滤膜的孔径为〇. 22 y m，滤膜过滤可以有效除去杂质，以 免影响检测结果的准确性。
[0016] 优选的，步骤（2)中，液相色谱-串联质谱法的色谱条件为：采用十八烷基健合硅 胶柱（C18柱），流动相由A相和B相组成，A相为水，B相为乙腈，采用梯度洗脱。
[0017] 进一步优选的，所述C18柱的粒径5 y m，柱内径为2. 1或4. 6mm，柱长为50、150或 250mm ;优选色谱柱为C182. 1 X 150mm，5 y m ;柱温为30°C，进样量：5 y L。
[0018] 更进一步优选的，喹乙醇、利巴韦林、金刚烷胺、金刚乙胺、地塞米松、氯霉素、呋 喃它酮和呋喃唑酮的检测条件：流速：〇. 2mL/min ;梯度洗脱程序：0-2min，B相保持5% ; 2_8min，B 相从 5%升至 95% ;8. 1-lOmin，B 相降至 5% ;10min 后停止；
[0019] 呋喃妥因、呋喃西林和己烯雌酚的检测条件：流速：0. 3mL/min，梯度洗脱程序： 0-51^11，8相从20%升至50%;5-7111111，8相从50%升至95% ;7-8111111，8相保持95%; 8. 1-lOmin B 相降至 5% ;10min 后停止。
[0020] 由于兽药粉剂中的这11种非法添加物中，有些物质的极性相差很小，难以保证在 有限的时间内将每种物质进行有效分离，所以，很难根据其性质确定流动相以及流动相的 配比，而流动相的种类很多，每种流动相的浓度也有很大差别，所以，流动相的确定和梯度 洗脱都是需要反复试验，需要发明人根据其多年工作经验，不断调整才能得到的。试验证 明，当流动相为以上两种，梯度洗脱程序为以上程序时，可以有效将这11种物质进行分离， 使这11种物质之间没有相互干扰，保证了试验结果的准确性。
[0021 ] 优选的，步骤（2)中，液相色谱-串联质谱法的质谱条件为：
[0022] 喹乙醇、利巴韦林、金刚烷胺、金刚乙胺、地塞米松、氯霉素、呋喃它酮和呋喃唑酮 的检测条件：离子源：API-ES ;毛细管电压：3000V ;雾化压力：35psi ;干燥气温度：325°C ; 干燥气流量：l〇L/min;离子极性：正；质量扫描模式:MRM模式（多反应监测模式）；
[0023] 呋喃妥因、呋喃西林和己烯雌酚的检测条件：离子源：API_ES;毛细管电压： 3000V;雾化压力：30psi;干燥气温度：300°C;干燥气流量：10L/min;离子极性：负；质量扫 描模式:MRM模式（多反应监测模式）。
[0024] 本发明方法还包括用各种非法添加的药物的标准品绘制标准曲线，并由此计算待 测兽药散剂中非法添加药物的含量，具体方法如下：取11种化学药物的对照品储备液，配 制一系列不同质量浓度的混合标准液，于上述条件和设定的11种非法添加药物的质谱参 数下分别进样测定，绘制11种非法添加药物的标准曲线，得到线性方程、相关系数和线性 范围。
[0025] 虽然在相关文献中已经公开了很多中兽药散剂中的非法添加药物，但是公开的非 法添加药物的数量很多，现有技术中还没有人提出将本发明中的11种物质的含量进行检 测，喹乙醇、利巴韦林、地塞米松、己烯雌酚、呋喃它酮、呋喃妥因以及呋喃唑酮都没有使用 液相色谱串联质谱的方法检测过，所以，这几种物质是否可以被该方法检测存在不可预期 性，即使可以使用该方法进行检测，由于没有现有的技术作为参考，很难确定每种物质利用 该方法进行检测的条件。
[0026] 既然这些物质单独存在时是否能使用该方法进行检测都是未知的，而多种物质同 时存在时，由于不同物质的极性不同或相差较小；或者不同物质之间存在相互作用，使物质 的极性发生改变，进而使原本可以分离的物质不能分离等，这些都是制约使用液相色谱串 联质谱方法进行同时检测的因素。所以，这11种物质是否能够同时检测或分几次才能检测 出来都是未知的，如过这些物质不能同时被检测，就会使实验的进行更加困难，这都需要发 明人的反复试验进行探索才能最终确定。所以使用本发明的方法来检测中兽药散剂中的这 11种物质不是显而易见的。
[0027] 本发明的有益效果为：
[0028] 1、本发明的样品预处理简单，以甲醇/水（50+50)作为提取试剂超声提取，过滤膜 后即可上机检测，且回收率良好，平均回收率为90. 2%~111%;
[0029] 2、本发明的方法具有更低的检出限，喹乙醇、利巴韦林、金刚烷胺、金刚乙胺、地塞 米松、氯霉素、呋喃它酮、呋喃唑酮的检出限为50 y g/kg;呋喃妥因、呋喃西林和己烯雌酚 的检出限为100 yg/kg，可以实现对中兽药散剂中这些非法添加药物更准确地检测。
【附图说明】
[0030] 图1为利巴韦林提取离子流谱图；
[0031] 图2为喹乙醇提取离子流谱图；
[0032] 图3为金刚烷胺提取离子流谱图；
[0033] 图4为金刚乙胺提取离子流谱图；
[0034] 图5为呋喃它酮提取离子流谱图；
[0035] 图6为呋喃妥因提取离子流谱图；
[0036] 图7为呋喃西林提取离子流谱图；
[0037] 图8为呋喃唑酮提取离子流谱图；
[0038] 图9为地塞米松提取离子流谱图；
[0039] 图10为己烯雌酚提取离子流谱图；
[0040]图11为氯霉素提取离子流谱图；
[0041] 图12和图13为检测实际样品中11种非法添加药物的总离子流图。
【具体实施方式】
[0042] 下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步说明。
[0043] 仪器与试剂：快速分离液