一种快速检测防腐剂苯甲酸超标的试纸条的制作方法
【技术领域】
[0001]属于食品安全检测领域，具体涉及食品中有还超标物质的检测方法，特别是一种苯甲酸试纸检测方法。
【背景技术】
[0002]苯甲酸又名苯酸或安息香酸，与水杨酸合用于成人皮肤真菌病，浅部真菌感染如体癣、手癣及足癣等，也用于定香剂或防腐剂。人经口 500mg/kg即会出现急性中毒现象?’人经口 6mg/kg最低中毒量，可有皮肤损害。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种特异性强，灵敏度高，且操作简单方便，对样品经过简单处理即可检测的苯甲酸快速试纸定量检测方法。
[0004]本发明的目的可通过以下技术方案来实现:
苯甲酸免疫层析试纸检测方法其技术要点是:试纸的被衬上依次贴有样液吸收部分和胶体金标记部分和检测反应部分和吸水部分，胶体金标记部分被标记的物质为苯甲酸检测用抗体；检测反应部分上面包被有苯甲酸抗原1条作为检测线，同时还包被有羊抗鼠IgG抗体1条作为参考线。在试纸制备时通过调节检测线和参考线包被物的浓度，控制检测时检测线和参考线的显色深浅，并将其显色深浅与标准物质浓度对应起来，达到半定量检测。
[0005]所述的检测用抗原是指苯甲酸与载体物质明胶形成的偶合物，免疫用抗原是指苯甲酸与载体物质是孔血蓝蛋白(KLH)形成的偶合物。
[0006]所述的载体物质也可以选用其他大分子物质，如:脂蛋白、多聚氨基酸、葡聚糖、卵清白蛋白等，但要求检测用抗原与免疫用抗原的载体无交叉免疫反应。
[0007]本发明所描述的试纸的各部分处理与功能如下:
被衬:为一面涂有不干胶的不吸水的韧性材料，如PVC板，起固定支持试纸其他组成部分的作用。
[0008]样液吸收部分制备:将聚酯膜或玻璃纤维纸浸入pH7.4的PBS中约2 min,取出，45°C左右烘干，即作为样液吸收部分，检测时起吸收样品溶液的作用，便于样品溶液向上移动。
[0009]胶体金标记部分的制备:该部分起固定胶体金标记的抗原或抗体的作用。制备步骤包括胶体金溶液的制备、胶体金标记苯甲酸抗原或苯甲酸抗体。胶体金标记部分处理。
[0010](1)胶体金溶液的制备:将氯金酸(HAuC14)用超纯水配制成1%的溶液。取超纯水1000 mL，加热至沸腾，加入10 mL 1%氯金酸溶液，再次加热至沸腾。然后加入10 mL 2%的柠檬酸三钠水溶液，继续加热至出现透明的橙红色为止，即为胶体金溶液。
[0011](2)胶体金标记苯甲酸抗体:将苯甲酸单克隆抗体或多克隆抗体用PBS (0.0lmol/L,pH7.4)溶解稀释至2-4mg/ml,每100mL胶体金溶液加入l_3mL 2-4 mg/ml的苯甲酸抗体震荡 2min，用 0.lmol/L 的1(2(:03，调节 pH 至 8.4，震荡 5min，加入 11% PEG-10000 2mL，震荡 5min,6000-13000r/min 离心 15min，除去上清，将沉淀用 PBS (0.01 mol /L，pH7.0-7.5)复溶，以 8000-15000r/min 离心 15min,除去上清，将沉淀用 PBS (0.01 mol/L, ρΗ7.0-7.5)稀释500-2000倍，产物作为金标苯甲酸抗体。
[0012](3)胶体金标记部分处理:将稀释后的金标苯甲酸抗原或金标苯甲酸抗体倒入一槽中，将玻璃纤维或滤纸浸入lmin，取出，37°C干燥后，即作为胶体金标记部分。
[0013]检测反应部分制备:用0.8%的戊二醛溶液或0.2%的碳二亚胺溶液浸泡硝酸纤维膜30min，取出，37°C烘干，上边包被1条不同浓度的苯甲酸检测用抗原线或苯甲酸抗体线作为检测线，同时包被1条羊抗鼠IgG抗体线作为参考线。当胶体金标记部分标记对象为苯甲酸检测用抗原时，检测线则包被苯甲酸抗体。此即为检测反应部分，该部分主要作用是将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。
[0014]吸水部分制备:将玻璃纤维纸或滤纸或吸水纸室温干燥后，即作为吸水部分。该部分主要作用在于将移动上来的多余的样品溶液吸收。
[0015]试纸组装:在背衬上依次粘贴样液吸收部分、胶体金标记部分、检测反应部分和吸水部分，即成苯甲酸检测试纸。
[0016]检测原理:检测原理因胶体金标记的对象不同，而稍有差异。
[0017]由于胶体金标记部分标记对象为苯甲酸抗体，所以样品中若含有苯甲酸，样品溶液被试纸的样液吸收部分吸收并通过毛细作用上移到达胶体金标记部分，样品溶液中的苯甲酸与胶体金标记的苯甲酸抗体反应形成结合物，结合物继续上移到检测线，因胶体金标记的苯甲酸抗体只有特定的结合位点，样品溶液中的苯甲酸与之结合后，检测线上的检测用抗原就不能再与胶体金标记的苯甲酸抗体结合，于是检测线无色，此即为阳性；当样品中没有苯甲酸时，胶体金标记的苯甲酸抗体到达检测线时被检测用抗原捕获，则形成肉眼可见的红色。无论样品中是否含有苯甲酸，胶体金标记的苯甲酸抗体和其中的杂蛋白上移到达参考线时都可被参
考线上包被的羊抗鼠IgG抗体捕获形成肉眼可见的红色，此即为参考线。
[0018]在试纸制备时通过调节检测线和参考线包被物浓度，从而控制检测时检测线和参考线的显色深浅，并将其显色深浅与标准物质浓度对应起来，即可达到半定量检测目的。
【附图说明】
[0019]图1是苯甲酸检测卡外壳及检测试纸条在外壳内的安置图。
[0020]图2是苯甲酸检测卡检测试纸条结构示意图。
[0021]图3是检测试纸条硝酸纤维素膜上显示印迹带示意图。
【具体实施方式】
[0022]苯甲酸检测卡是在检测卡外壳1中设置检测试纸条2，检测卡外壳1的结构及检测试纸条2的设置见附图1,检测卡外壳1为长条扁平薄壳状外壳，长70mm，宽20mm，厚5mm，薄壳壁厚1_，由工程塑料制成，检测卡外壳1由上盖和下盖两半联接而成，在检测卡外壳1上盖上有检测窗孔3和加样孔4。检测试纸条2放置在检测卡外壳1的下盖内。
[0023]检测试纸条2是多层结构的窄条薄片，片长60_，片宽约4_，厚度小于2.5_。检测试纸条2是多层结构:底层是支承背板5,为聚乙烯薄片,厚度约0.5_，长60 mm，宽4mm ;支承背板5中部粘贴硝酸纤维素膜6，硝酸纤维素膜厚0.5mm,长20mm，宽4mm。硝酸纤维素膜6上有两条间隔开的横向显示印迹带，参见附图3，两条显示印迹中，一条是检测线10，含苯甲酸偶联物，另一条是参照线11，含羊抗鼠IgG抗体。支承背板5 —端上粘贴吸水纸9，另一端粘贴样品垫8，吸水纸9内端与硝酸纤维素膜6搭接，样品垫8与硝酸纤维素膜6之间则有一段金标垫7,由金标垫7将样品垫8与硝酸纤维素膜6连接在一起，搭接宽度在l-2mm。样品垫8材料为吸水玻璃纤维或聚酯膜。
[0024]使用饮料中防腐剂苯甲酸的试纸条时，先将待检测的样品液(药物的抽提液稀释后，直接用于检测)从加样孔4中滴入苯甲酸检测试纸条2的样品垫8，由于虹作用原理，带动待检测的样品液及胶体金膜7所含的抗苯甲酸单克隆抗体胶体金标记物一起向硝酸纤维素膜6扩散，5-10分钟内观察结果。
[0025]检测卡的主要反应是免疫学的抗原和抗体反应，在硝酸纤维素膜上迁移的胶体金标记的抗体，在测试线上与含有苯甲酸蛋白质偶联物，以及参照线含羊抗鼠IgG抗体反应，形成棕红色条带。若样品中相应的待测苯甲酸高于允许值，样品加入后先与金标垫中的抗体反应，而不会与检测带所带有的苯甲酸蛋白质偶联物反应，从而不显色。主要原因有以下3种情况:
1.检测线10和参照线11同时显现棕红色印迹，表示检测结果为阴性，说明被测样品中不含苯甲酸或含量低于允许值。
[0026]2.检测线10不显色，参照线11显现棕红色印迹，表示检测结果为阳性，说明被测样品中苯甲酸含量高于允许值。
[0027]3.检测线10显现棕红色印迹，参照线11不显色，或检测线10和参照线11均不显色，表示检测试纸条失效。
【主权项】
1.罐装食品、饮料中防腐剂苯甲酸的试纸条，其特征在于:在试纸的背衬上依次贴有样液吸收部分、胶体金标记部分、检测反应部分和吸水部分，胶体金标记部分被标记的物质为苯甲酸抗体；检测反应部分包被有检测用苯甲酸抗原1条作为检测线，同时还包被有羊抗鼠IgG抗体1条作为参照线。2.根据权利要求1所述的罐装食品、饮料中防腐剂苯甲酸的试纸条，其特征在于:苯甲酸检测用抗原为苯甲酸与载体物质形成的偶合物。3.根据权利要求2所述的饮料中防腐剂苯甲酸的试纸条，其特征在于:所述的载体物质，为蛋白质、蛋白质片段、合成多肽、半合成多肽或多糖。
【专利摘要】本发明涉及罐装食品、饮料中防腐剂苯甲酸的试纸条。该方法在试纸的被衬上依次粘贴有样液吸收部分、胶体金标记部分、检测反应部分及吸水部分。检测反应部分上面包被有检测用抗原1条作为检测线，同时还包被有羊抗鼠IgG抗体1条作为参照线。该快速检测试纸条特异性强，能够半定量检测，环境温度为4-40℃都可以使用，适合于罐装食品、饮料生产厂，食品卫生质检部门等进行苯甲酸超标的快速检测。本发明具有特异性强、灵敏性高、能够实现半定量检测，且操作简单方便等有益效果。
【IPC分类】G01N33/02
【公开号】CN105277665
【申请号】CN201410354542
【发明人】杜霞, 洪霞, 江振飞
【申请人】江苏维赛科技生物发展有限公司
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2014年7月24日