基于双编码和单分子计数的细胞因子多重检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于双编码和单分子计数的细胞因子多重检测方法。
【背景技术】
[0002] 细胞因子是由免疫细胞分泌的一类低分子蛋白，通常在免疫反应中发挥着信号转 导的作用。最近，研究发现一些细胞因子介导的信号通路与肿瘤细胞的生存、入侵和转移有 关，因此这些细胞因子已被当做癌症诊断和治疗的生物标志物。然而，由于一种癌症可能有 多个标志物或者一种标志物可能对应多种癌症，因此利用多种生物标志物对癌症进行检测 更加准确可行。
[0003] 常用的细胞因子检测方法是酶联免疫吸附测试（ELISA)，该方法需要首先将细胞 因子固定在特异性抗体上，然后利用酶或荧光团标记的二抗对其进行检测。但是由于该方 法中目标物与信号的比例是1:1，其灵敏度仍然受到限制。另外，对于多重检测来说，这种方 法也具有易产生假阳性信号、光谱重叠、淬灭效率不均一和仪器要求复杂等缺点。为了解决 这些问题，多分子标记的微球、纳米线、条码策略和杂交链反应等被用于提高细胞因子检测 的灵敏度。其中，条码策略具有很高的扩增效率，已被广泛用于生物标志物的灵敏检测。
[0004] 条码分析作为一种灵敏的分析策略，是一种将短的寡核苷酸序列作为替代目标物 的生物分析方法。传统的条码分析通常包括磁纳米颗粒和金属纳米颗粒，它们都修饰了识 别单元，因此都能够识别目标物并形成三明治结构。另外，金属纳米颗粒上还修饰了大量的 寡核苷酸序列，即条码链。由于纳米颗粒的富集作用，少量目标物序列即可被转化为大量条 码链，因此这种方法通常具有很高的灵敏度。基于条码扩增策略，Mirkin课题组构建了一 个蛋白类癌症标志物的多重检测方法，检测限达170pM。但是由于此类癌症标志物在血清中 的含量极低，其灵敏度仍然无法满足实际检测的需要。此外，该方法需要将条码链从纳米颗 粒上释放，增加了检测的复杂性。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种基于双编码和单分子计数的细胞 因子多重检测方法。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] -种基于双编码和单分子计数的细胞因子多重检测方法，步骤如下：（1)将目 标物的抗体固定在硅烷化的玻璃基底上；（2)将目标物和磁纳米探针依次加入到上述的 玻璃基底上形成三明治式的免疫复合物，所述磁纳米探针通过将二抗和寡核苷酸修饰到 streptavidin-MNBs上制得，所述的寡核苷酸链作为一级条码链；（3)上述的一级条码链作 为扩增原件触发多分枝的杂交链反应，产生带有多条分支的长双链结构；(4)所述的长双 链结构作为二级条码链与多分子标记的荧光探针结合，产生荧光；（5)通过数点进行计数。
[0008] 具体的：一种基于双编码和单分子计数的细胞因子多重检测方法，步骤如下：
[0009] 首先将待测样品（优选血清）加入相应抗体包被的基底上，37°C孵育l-3h(优选 2h)，利用PBS-T和PBS分别清洗后，加入磁纳米探针，37°C孵育l-3h (优选2h)后，除去未 反应的磁纳米探针；接着，加入发夹结构混合物，和HCR缓冲液，37°C孵育2-4h (优选3h)， 利用PBS-T和PBS分别清洗后，加入荧光探针，37°C孵育3-5h (优选4h)，最后利用PBS-T和 PBS分别清洗，加入PBS，在倒置显微镜下进行成像。
[0010] 优选：抗体被基体的制备：向硅烷化的玻璃基底加入抗体37°C下过夜孵育；接着， 加入质量浓度（w/v)5% (取5yg BSA粉末加入到100yL PBS缓冲液中即得。）的BSA(牛 血清蛋白）溶液在37°C下封闭5-8h (优选6h)。
[0011] 优选：磁纳米探针的制备：首先，在外加磁场的作用下，将streptavidin-MNBs加 入到TTL缓冲液中清洗，清洗完成后加入PBS使其悬浮，取str印tavidin-MNBs溶液并加入 生物素化的条码链（Ι-bio-strand和2-bio-strand，序列见表1)，37°C下反应，将得到的悬 浮液在外加磁场的作用下，用PBS清洗后最终产物即为磁纳米探针，加入PBS备用；
[0012] 优选：多分子标记荧光探针的组装：首先将三条荧光标记的单链 DNA (1-Ca, 1-Cb, 1-Cc 或 2-Ca, 2-Cb, 2-Cc 序列见表 1)和一条长的单链 DNA (1-Cd 或 2-Cd 序 列见表1)分别用TE缓冲液稀释；然后分别将各单链DNA加入TM缓冲液中，混匀；接着将混 合物放入95 °C的金属浴中，退火或淬火，制得荧光探针。
[0013] 上述的方法应用于非诊断目的体外检测样品。
[0014] -种基于双编码和单分子计数的细胞因子检测试剂盒，其特征是：包括被检测细 胞因子相应的一抗，硅烷化的玻璃基底，磁纳米探针，所述磁纳米探针被检测细胞因子相应 的二抗和寡核苷酸修饰，发夹结构DNA，所述发夹结构DNA具有与所述磁纳米探针的寡核苷 酸配对的碱基序列，并且配对形成带有多条分支的长双链结构，荧光探针，所述荧光探针是 由四条单链DNA杂交产生的十字形结构，其一端是伸出的悬垂序列，另外三端都标记了荧 光基团，所述悬垂序列与带有多条分支的长双链结构结合。
[0015] 本发明的有益效果：
[0016] 本发明的方法首次将条码分析和单分子计数相结合用于蛋白质的检测，方法的灵 敏度为5fM，且能够实现复杂样本中两种以及两种以上目标物的同时检测。此外，我们对人 血清样本进行了分析，说明这种方法是可靠的，在临床检测中具有很大的应用潜力。
[0017] 该方法不需要将条码链从纳米颗粒上释放，步骤简单。
【附图说明】
[0018] 图1为本发明方法的原理图；
[0019] 图2为荧光探针的凝胶电泳分析，1-5条带是淬火产物的电泳图像，6-10是由 退火产物的电泳图像，分别是 1-Cd、l-Cd+1-Cc、l-Cd+1-Cc+l-Cb、l-Cd+1-Cc+l-Ca 和 1-Cd+l-Cc+l-Cb+l-Ca，Μ 是 marker ;
[0020] 图3为荧光点数与目标物浓度的线性关系图；
[0021] 图4为不同目标物的焚光响应，1是牛血清白蛋白，2是凝血酶，3是IgG，4是甲胎 蛋6白，5是癌胚抗原，6是IFN- γ和TNF- α。
【具体实施方式】
[0022] 试剂和材料人肿瘤坏死因子α (TNF-α )、重组人干扰素γ (IFN-γ)、肿瘤坏死因 子α抗体（anti-TNF-α)、生物素化肿瘤坏死因子α抗体（bio-anti-TNF-α)、干扰素γ 抗体（anti-IFN-γ)、生物素化的干扰素γ抗体（bio-anti-IFN-γ)和人Ig G购自Abeam 公司。链霉亲和素化的磁球（streptavidin_MNBs，350nm)购自Bangs Laboratories公司。 牛血清白蛋白（BSA)购自上海生工生物工程有限公司（上海）。实验中用到的所有溶液都 是由超纯水配制，所有核酸序列由英潍捷基有限公司合成（北京）。
[0023] 仪器落射焚光显微镜系统（Olympus Opatical Co. Ltd, Tokyo, Japan)，主要包 括倒置显微镜（Olympus IX 81)，卤素灯（Olympus LG-PS2)，倒置荧光显微镜控制单元 (Olympus IX2-UCB)，电子多级放大电感親合器（Electron Multiplying Charge Coupled Device，EMCCD，Cascade 512B, Roper Scientific，Tuscon，AZ. USA)，MetaMorph 软件系统 (Universal Imaging，Downingtown，PA，USA);精密光学隔振平台（上海亿奥信息光学科 技有限公司，上海）；超声清洗机（Branson-200型，中美合资必能信超有限公司，上海）； DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司，上海）；DNP-9052型电热 恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司，上海）。
[0024] 抗体包被基底的制备首先制备硅烷化的玻璃基底，然后向基底加入50 μ L相 应抗体（anti-IFN-yand anti-TNF-a，〇· OlnM)过夜孵育。接着，加入5%的BSA溶液 在37°C下封闭6h。每一步完成后都要分别用PBS-T(0. 15M NaCl，7. 6mM Na2HP04,2. 4mM NaH2P04, 0· 05 % 吐温-20, PH 7. 4)和 PBS (0· 15M NaCl，7. 6mM Na2HP04, 2. 4mM NaH2P04, pH 7. 4)缓冲液清洗三次，以出去未反应的试剂。
[0025] 磁纳米探针的制备首先，在外加磁场的作用下，将2 μ L streptavidin-MNBs加入 到 200 μ L TTL 缓冲液（100mM Tris, 1M LiCl, 0· 1 % Tween-20, pH 8. 0)中清洗 5 次。清洗 完成后加入60yL PBS使其悬浮。然后，取30yL str印tavidin-MNBs溶液并加入10yL生 物素化的条码链（l-bi〇-strand和2-bio-strand，核苷酸序列见表1)，37°C下反应5h。接 着，将得到的悬浮液在外加磁场的作用下，用PBS清洗三次。最终产物即为磁纳米探针，加 入50yL