PBS备用。
[0026] 多分子标记荧光探针的组装和电泳验证首先将三条荧光标记的单链 DNA(1-Ca，1-Cb，1-Cc or 2-Ca，2-Cb，2-Cc，核苷酸序列见表 1)和一条长的单链 DNA(1-Cd 或2-Cd，核苷酸序列见表1)分别用TE缓冲液（10mM Tris，ImM Na2EDTA，pH 8. 0)稀释至 10 μ M。然后分别取 10 μ L 各单链 DNA 加入 60 μ L TM 缓冲液（20mM Tris, 50mM MgCl2, pH 8. 0)中，混匀。接着将混合物放入95°C的金属浴中，2min中降至30°C (退火）或立刻放入 4°C的冰水中（淬火），继而得到两种方法产生的荧光探针，其终浓度为0. 1 μ M。
[0027] 为了验证该荧光纳米探针的形成和选择最优的合成方法，我们利用12%的聚丙烯 酰胺（native-PAGE)对其进行了电泳实验实验。
[0028] 基于双条码策略和单分子计数的多重分析方法的构建首先将50 yL目标物 (IFN- γ和TNF- α )加入抗体包被的基底上，37°C孵育2h。利用PBS-T和PBS分别清洗三 次后，加入50 μ L磁纳米探针。37°C孵育2h后，利用磁分离技术将未反应的磁纳米探针 洗去。接着，加入50 μ L发夹结构混合物（各发夹结构的核苷酸序列见表1)，包括10 μ L HI (1-Η1 和 2-Η1, 0· 2 μ Μ)、10 μ L Η2 (1-Η2 和 2-Η2, 0· 22 μ Μ)和 30 μ L HCR 缓冲液（50mM Na2HP04, 0. 5NaCl, pH 6. 8)，37°C下孵育4h。利用PBS-T和PBS分别清洗三次后，加入50 μ L 荧光探针，37°C下孵育4h。最后利用PBS-T和PBS分别清洗三次，加入50PBS，在倒置显微 镜下进行成像。
[0029] 原理如图1，首先，通过环氧基-羟基反应，将目标物IFN-γ和TNF-α的抗体固定 在硅烷化的玻璃基底上，同时，通过将二抗和寡核苷酸修饰到streptavidin-MNBs上制备 磁纳米探针。其中，二抗发挥分子识别的作用，寡核苷酸链即为一级条码链。接着，将目标 物和磁纳米探针依次加入到基底上，通过抗原抗体间的免疫反应形成三明治式的免疫复合 物。接下来，一级条码链作为扩增原件触发多分枝的杂交链反应（mHCR)，产生带有多条分支 的长双链结构。该分支作为二级条码链能够与多分子标记的荧光探针结合，产生荧光。最 后通过倒置显微镜数点进行计数。
[0030] 多分子荧光探针的组装和表征
[0031] 发明人设计了一个标记有三个焚光分子的新型焚光探针，成为多分子标记的焚光 探针。该探针是由四条单链DNA杂交产生的十字形结构，其一端是伸出的悬垂序列，另外三 端都标记了荧光基团。
[0032] 发明人选择了两种方法，即退火和淬火分别对该探针进行合成，为了表征探针的 成功合成并选择最佳方法，我们进行了电泳实验。如图2,5和10条带分别是由退火和淬火 得到的荧光探针，从图中可以看出，退火的方法得到的探针条带更亮，说明产率更高。
[0033] 条件优化
[0034] 发明人分别对BSA封闭时间、一级编码链浓度、H1浓度、H2与H1的比例以及荧光 探针孵育时间进行了优化。最终选择BSA封闭时间为6h，一级编码链浓度为0. 2 μ M，H1浓 度为0. 2 μΜ，Η2/Η1为1. 1，荧光探针孵育时间为4h。
[0035] 方法学验证
[0036] 在最优条件下，发明人首先对方法的灵敏度进行了考察，如图3,在5fM_100fM范 围内，荧光点数与目标物的线性关系良好，线性方程分别为Yi= 6. 207+7. 541C JP Y 2 = 5. 034+7. 555C2，对两种目标物的检测限均为5fM。
[0037] 接着，发明人对方法的特异性进行了考察，如图4,该方法仅对目标物具有较强的 荧光响应，对其它目标物的荧光响应较小，说明这个方法具有很好的特异性。
[0038] 最后，发明人利用这种方法对人血清进行了分析，如表2,得到人血清中IFN-γ和 TNF-α 的量分别是 1. 04-1. 07X 10 13mol/L 和 3. 29-5. 26X 10 13mol/L，实现了对血清中两 种目标物的定量。
[0039] 表1所用到的核酸序列
[0040]
[0042] 表2人血清定量检测
[0044] 上述虽然结合附图对本发明的【具体实施方式】进行了描述，但并非对本发明保护范 围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不 需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
【主权项】
1. 一种基于双编码和单分子计数的细胞因子多重检测方法，其特征是：步骤如下：（1) 将目标物的抗体固定在硅烷化的玻璃基底上；（2)将目标物和磁纳米探针依次加入到步骤 (1)的玻璃基底上形成三明治式的免疫复合物，所述磁纳米探针通过将二抗和寡核苷酸修 饰到streptavidin-MNBs上制得，所述的寡核苷酸链作为一级条码链；（3)步骤（2)的一级 条码链作为扩增原件触发多分枝的杂交链反应，产生带有多条分支的长双链结构；(4)步 骤（3)的长双链结构作为二级条码链与多分子标记的荧光探针结合，产生荧光；(5)通过数 点进行计数。2. -种基于双编码和单分子计数的细胞因子多重检测方法，其特征是：步骤如下： (1)首先将待测样品加入相应抗体包被的基底上，37°C孵育2h; (2)利用PBS-T和PBS分别清洗后，加入磁纳米探针，37°C孵育2h后，形成三明治式的免疫复合物，除去未反应的 磁纳米探针，所述磁纳米探针具有相应二抗和寡核苷酸的修饰；(3)加入发夹结构混合物 和HCR缓冲液，37°C孵育4h，所述发夹结构与磁纳米探针上的寡核苷酸配对形成带有多条 分支的长双链结构；（4)利用PBS-T和PBS分别清洗后，加入荧光探针，37°C孵育4h，所述荧 光探针是由四条单链DNA杂交产生的十字形结构，其一端是伸出的悬垂序列，另外三端都 标记了荧光基团，所述悬垂序列与带有多条分支的长双链结构结合；（5)利用PBS-T和PBS 分别清洗，加入PBS，通过倒置显微镜数点进行计数。3. 如权利要求2所述的检测方法，其特征是：所述待测样品为血清样品。4. 如权利要求2所述的检测方法，其特征是：所述荧光探针是将三条荧光标记的单链 DNA和一条长的单链DNA分别用TE缓冲液稀释，然后分别将各单链DNA加入TM缓冲液中， 混匀，接着将混合物放入95°C的金属浴中，退火或淬火制得。5. 如权利要求4所述的检测方法，其特征是：所述三条荧光标记的单链序列为：SEQID N0:14、SEQIDN0:14、SEQIDN0:14或SEQIDN0:14、SEQIDN0:14、SEQIDN0:14和一 条长的单链DNA的序列为：SEQIDNO: 14或SEQIDNO: 14。6. 如权利要求2所述的检测方法，其特征是：所述步骤（1)中抗体包被基体的制备方 法如下：向硅烷化的玻璃基底加入抗体37°C下过夜孵育；接着，加入质量浓度为5%的BSA 溶液在37°C下封闭5-8h。7. 如权利要求6所述的检测方法，其特征是：加入质量浓度为5%的BSA溶液在37°C 下封闭6h。8. 如权利要求2所述的检测方法，其特征是：所述步骤⑵中磁纳米探针的制备方法： 首先，在外加磁场的作用下，将streptavidin-MNBs加入到TTL缓冲液中清洗，清洗完成后 加入PBS使其悬浮，取str印tavidin-MNBs溶液并加入生物素化的条码链，37°C下反应，将 得到的悬浮液在外加磁场的作用下，用PBS清洗后最终产物即为磁纳米探针。9. 如权利要求8所述的检测方法，其特征是：所述生物素化的条码链的序列为：SEQID NO:1和SEQIDNO:2。10. -种基于双编码和单分子计数的细胞因子检测试剂盒，其特征是：包括被检测细 胞因子相应的一抗，硅烷化的玻璃基底，磁纳米探针，所述磁纳米探针被检测细胞因子相应 的二抗和寡核苷酸修饰，发夹结构DNA，所述发夹结构DNA具有与所述磁纳米探针的寡核苷 酸配对的碱基序列，并且配对形成带有多条分支的长双链结构，荧光探针，所述荧光探针是 由四条单链DNA杂交产生的十字形结构，其一端是伸出的悬垂序列，另外三端都标记了荧 光基团，所述悬垂序列与带有多条分支的长双链结构结合。
【专利摘要】本发明公开了一种基于双编码和单分子计数的细胞因子多重检测方法，将一抗固定在同一个玻璃基底上，通过抗原抗体的相互作用，分别固定目标物。同时，在磁纳米颗粒上修饰二抗和一级编码链，得到磁纳米探针。接着，利用二抗和抗原间的特异性结合作用，将磁纳米探针固定在基底上，形成三明治结构的免疫复合物。磁纳米探针上的一级条码链作为扩增单元触发多分枝的杂交链反应，生成带有多重分支的双链结构。该分支链即为二级编码链。最后，二级编码链与一种多分子标记的荧光探针结合，产生增强的荧光信号，通过清点荧光点的数目对目标物进行定量。该方法实现了细胞因子的多重、灵敏检测，两种目标物的检测限均为5fM。
【IPC分类】G01N33/68, G01N33/533
【公开号】CN105353131
【申请号】CN201510698254
【发明人】王磊, 姜玮, 李伟
【申请人】山东大学
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年10月23日