一种同时检测5种金黄色葡萄球菌肠毒素a、b、c、d、e的胶体金试纸条及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种同时检测5种金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E的胶体金试纸条及其制备方法，属于免疫分析技术领域。
【背景技术】
[0002]金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种常见的食源性致病菌。该菌广泛存在于自然界中，人体皮肤、空气、水中均有分布。食品容易污染金黄色葡萄球菌，在适宜温度下可以迅速增殖并产生金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxin，SE)，微量的肠毒素即可引起人类食物中毒。金黄色葡萄球菌肠毒素类型众多，但根据文献报道95%的金黄色葡萄球菌食物中毒是由SEA、SEB、SEC、SED、SEE引起的。
[0003]金黄色葡萄球菌肠毒素是世界性卫生难题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒，占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则占45%，近年来我国金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件也时有发生。
[0004]在食品加工过程中，经过热处理可以杀灭金黄色葡萄球菌。然而，一旦菌体产生外分泌的肠毒素，存在于食物中的肠毒素非常稳定，100°C 30min不被破坏，摄入人体后仍可以抵抗肠胃液中蛋白酶的分解，并引起人体的呕吐、腹泻等症状。2011年我国公布速冻面米制品新国标GB19295—2011，金黄色葡萄球菌由原来的不得检出变为限量检出，因此为了杜绝食品中金黄色葡萄球菌活菌数合格而肠毒素超标的情况，肠毒素的快速检测对于保障食品安全具有更加重要的意义。
[0005]目前检测金黄色葡萄球菌肠毒素主要有传统方法包括动物感染实验，免疫琼脂扩散法等血清学方法以及免疫分析方法包括ELISA和胶体金试纸条。传统检测方法实验耗时长，成本高，检测灵敏度差，不适合食品样品的快速筛查。胶体金试纸条凭借其快速、灵敏、特异性好、操作简便的特点越来越多地用于食品安全领域的现场快速检测。开发可以同时检测5种主要金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E的胶体金试纸条方法可以大大提高食品样品的筛查效率，具有较好应用前景。
【发明内容】
[0006](一)要解决的技术问题
本发明的目的在于开发一种可以同时检测5种金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E的胶体金试纸条，用于食品中金黄色葡萄球菌肠毒素的高效、快速检测。同时本发明公布了该试纸条的制备方法。
[0007]( 二)技术方案
为实现上述目的，本发明采用了如下的技术方案:
一种同时检测5种金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E的胶体金试纸条:
在硝酸纤维素膜10上依次标记好5条测试线3，4，5，6，7和1条质控线8的位置，间隔6mm ;将金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E对应的特异性捕获抗体JN2011-01即CGMCC8.90001, K3 即 CGMCC N0.10863，1G7 即 CGMCC N0.10867，5F2 即 CGMCC N0.7212，1E5 即 CGMCCN0.7214稀释到lmg/mL，分别用喷膜机(B1jet Quanti3000)将肠毒素A、B、C、D、E对应的捕获抗体对应喷至测试线7、6、5、4、3处；将0.5mg/mL的羊抗鼠IgG 二抗喷至质控线8处；37°C烘干2h并切条备用；
将吸附垫9粘附在硝酸纤维素膜10靠近质控线8的一端，将样品垫1粘附在硝酸纤维素膜10的靠近测试线3的另一端；将硝酸纤维素膜10粘贴固定于PVC底板11上，4°C保藏至使用前；
采用湿法检测，样品垫1与测试线3之间在硝酸纤维素膜10中间设有金标垫；金标垫上设有金标检测抗体2 ；
样品垫1上的目标物先跟金标检测抗体2反应，再逐个与测试线3，4，5，6，7上的捕获抗体反应；
测试线7、6、5、4、3分别包被有金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E对应的特异性捕获抗体；
质控线8包被有羊抗鼠IgG 二抗；
吸附垫9与样品垫1，硝酸纤维素膜10均粘附在PVC底板11上。
[0008]所述的同时检测5种金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E的胶体金试纸条，金标检测抗体2为金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E对应的检测抗体JN2011-02即CGMCC8.90002，1F6 即 CGMCC N0.10866，1H8 即 CGMCC N0.10868，10F1 即 CGMCC N0.7213，2E3 即CGMCC N0.7215的混合物；测试线7，6，5，4，3分别包被了金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E对应的特异性捕获抗体 JN2011-01 即 CGMCC 8.90001, K3 即 CGMCC N0.10863，1G7 即 CGMCCN0.10867，5F2 即 CGMCC N0.7212，1E5 即 CGMCC N0.7214。
[0009]所述的同时检测5种金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E的胶体金试纸条的制备方法，包括以下步骤:
1、金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E夹心法配对抗体的制备:
分别用重组表达的金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E (北京军事医学科学院)免疫7周龄BALB/c小鼠，免疫原与弗氏佐剂乳化后进行免疫，首免，二免，三免的免疫剂量分别为15 μ g/只，15 μ g/只，7.5 μ g/只；用细胞融合技术及间接ELISA方法筛选强阳性细胞株；纯化后的单克隆抗体分别标记过氧化物酶(HRP)并进行两两配对，用夹心法作标准曲线并挑选检测灵敏度最高的配对研制胶体金试纸条。
[0010]2、胶体金的合成:
采用柠檬酸还原法合成30nm的金纳米粒子。在洗净的烧瓶中加入300mL质量浓度
0.01%的氯金酸溶液，在磁力搅拌下加热至完全沸腾。向溶液中快速加入4.8mL质量浓度1%的柠檬酸三钠溶液。将溶液煮沸lOmin直至颜色变为透亮的酒红色。将烧瓶置于室温冷却，并在4°C保藏。
[0011]3.金标检测抗体的制备:
分别将金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E对应的检测抗体JN2011-02即CGMCC8.90002，1F6 即 CGMCC N0.10866，1H8 即 CGMCC N0.10868，10F1 即 CGMCC N0.7213，2E3 即CGMCC N0.7215标记胶体金颗粒。具体过程为:用0.1M碳酸钾溶液将lmL胶体金溶液pH调至8 ;加入JN2011-02，1F6，1H8，10F1，2E3五种单克隆抗体各10 μ g并在室温下反应2h ;4°C、6000g、20min条件下离心胶体金溶液，去除未偶联的胶体金和单克隆抗体；用含有0.2%Tween、0.2%蔗糖的0.01M的磷酸盐缓冲液洗涤金标检测抗体。
[0012]4、测试线和质控线的制备
在硝酸纤维素膜上标记好5条测试线和1条质控线的位置，间隔6mm。将金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E对应的特异性捕获抗体JN2011-01，K3，1G7，5F2及1E5稀释到lmg/mL，分别用喷膜机(B1jet Quanti3000)将A、B、C、D、E对应的捕获抗体喷至测试线7、6、5、4、3处。将羊抗鼠IgG 二抗(0.5mg/mL)喷至质控线8处。37°C烘干2h并切条备用。
[0013]5、试纸条的组装
将吸水垫9粘附在硝酸纤维素膜10靠近质控线8的一段。将样品垫1粘附在硝酸纤维素膜10的靠近测试线3的另一端。将硝酸纤维素膜10固定于PVC底板11上，样品垫1与测试线3之间在硝酸纤维素膜10中间设有金标垫；金标垫上设有金标检测抗体2 ;4°C保藏至使用前。
[0014]所述同时检测5种金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E的胶体金试纸条的应用:适用于食品样品和临床样本的快速同时检测，对5种金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E的肉眼最低检测限分别为 5ng/mL、5 ng/mL、5 ng/mL、2.5 ng/mL 及 10 ng/mL。
[0015](三)有益效果
本发明建立了可以同时检测5种金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E的胶体金试纸条。同时检测5种金黄色葡萄球菌肠毒素的原理为:胶体金试纸