合成30nm的金纳米粒子。在洗净的烧瓶中加入300mL 0.01%的氯金酸溶液，在磁力搅拌下加热至完全沸腾。向溶液中快速加入4.8mL 1%的柠檬酸三钠溶液。将溶液煮沸lOmin直至颜色变为透亮的酒红色。将烧瓶置于室温冷却，并在4°C保藏；
b、金标检测抗体的制备:
分别将金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E对应的检测抗体JN2011-02，1F6，1H8，10F1，2E3标记胶体金颗粒。具体过程为:用0.1M碳酸钾溶液将lmL胶体金溶液pH调至8 ;加入JN2011-02，1F6，1H8，10FL2E3五种单克隆抗体各10 μ g并在室温下反应2h ;4°C、6000g、20min条件下离心胶体金溶液，去除未偶联的胶体金和单克隆抗体；用含有0.2%Tween、0.2%蔗糖的0.01M的磷酸盐缓冲液洗涤金标抗体；
c、测试线和质控线的制备
在硝酸纤维素膜上标记好5条测试线和1条质控线的位置，间隔6mm。将金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E对应的特异性捕获抗体JN2011-01，K3，1G7，5F2及1E5稀释到lmg/mL，分别用喷膜机(B1jet Quanti3000)将A、B、C、D、E对应的捕获抗体喷至测试线7、6、5、4、3处。将羊抗鼠IgG 二抗(0.5mg/mL)喷至质控线8处。37°C烘干2h并切条备用；
d、试纸条的组装
将吸水垫粘附在硝酸纤维素膜靠近质控线8的一端。将样品垫粘附在硝酸纤维素膜的靠近测试线3的另一端。将硝酸纤维素膜固定于PVC底板上，样品垫1与测试线3之间在硝酸纤维素膜10中间设有金标垫；金标垫上设有金标检测抗体2 ;4°C保藏至使用前。
【主权项】
1.一种同时检测5种金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E的胶体金试纸条，其特征在于:在硝酸纤维素膜(10)上依次标记好5条测试线(3，4，5，6，7)和1条质控线(8)，间隔6mm ;将金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E对应的特异性捕获抗体JN2011-01即CGMCC8.90001, K3 即 CGMCC N0.10863，1G7 即 CGMCC N0.10867，5F2 即 CGMCC N0.7212，1E5 即 CGMCCN0.7214稀释到lmg/mL，分别用喷膜机B1jet Quanti3000将肠毒素A、B、C、D、E对应的捕获抗体对应喷至测试线(7、6、5、4、3)处；将0.5mg/mL羊抗鼠IgG 二抗喷至质控线(8)处；37°C烘干2h，并切条备用；将吸附垫(9)粘附在硝酸纤维素膜(10)靠近质控线(8)的一端，将样品垫(1)粘附在硝酸纤维素膜(10)靠近测试线(3)的另一端；将硝酸纤维素膜(10)粘贴固定于PVC底板(11)上，4°C保藏至使用前； 样品垫(1)与测试线(3)之间在硝酸纤维素膜(10)中间设有金标垫；金标垫上设有金标检测抗体(2)； 测试线(7、6、5、4、3)分别包被有金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E对应的特异性捕获抗体； 质控线(8 )包被有羊抗鼠I gG 二抗； 吸附垫(9)与样品垫(1 )，硝酸纤维素膜(10)均粘附在PVC底板(11)上。2.权利要求1所述的同时检测5种金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E的胶体金试纸条，其特征在于金标检测抗体(2)为金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E对应的检测抗体 JN2011-02 即 CGMCC 8.90002，1F6 即 CGMCC N0.10866，1H8 即 CGMCC N0.10868，10F1 即CGMCC N0.7213，2E3即CGMCC N0.7215的混合物；测试线(7、6、5、4、3)分别包被了金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E对应的特异性捕获抗体JN2011-01即CGMCC 8.90001，K3即CGMCC N0.10863，1G7 即 CGMCC N0.10867，5F2 即 CGMCC N0.7212，1E5 即 CGMCC N0.7214。3.权利要求1所述的同时检测5种金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于包括以下步骤: a、金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E夹心法配对抗体的制备:分别用重组表达的金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E免疫7周龄BALB/c小鼠，免疫原与弗氏佐剂乳化后进行免疫，首免，二免，三免的免疫剂量分别为15 μ g/只，15 μ g/只，7.5 μ g/只；用细胞融合技术及间接ELISA方法筛选强阳性细胞株；纯化后的单克隆抗体分别标记过氧化物酶HRP并进行两两配对，用夹心法作标准曲线并挑选检测灵敏度最高的配对研制胶体金试纸条； b、胶体金的合成: 采用柠檬酸还原法合成30nm的金纳米粒子，在洗净的烧瓶中加入300mL质量浓度0.01%的氯金酸溶液，在磁力搅拌下加热至完全沸腾，向溶液中快速加入4.8mL质量浓度1%的柠檬酸三钠溶液，将溶液煮沸lOmin直至颜色变为透亮的酒红色，将烧瓶置于室温冷却，并在4°C保藏； C、金标检测抗体的制备:分别将 A、B、C、D、E 对应的检测抗体 JN2011-02 即 CGMCC 8.90002，1F6 即 CGMCCN0.10866，1H8 即 CGMCC N0.10868，10F1 即 CGMCC N0.7213，2E3 即 CGMCC N0.7215 标记胶体金颗粒，具体过程为:用0.1M碳酸钾溶液将lmL胶体金溶液pH调至8 ;加入JN2011-02，1F6，1H8，10FL2E3五种单克隆抗体各10 μ g并在室温下反应2h ;4°C、6000g、20min条件下离心胶体金溶液，去除未偶联的胶体金和单克隆抗体；用含有0.2%Tween、0.2%鹿糖的0.01M的磷酸盐缓冲液洗涤金标检测抗体； D、测试线和质控线的制备 在硝酸纤维素膜上标记好5条测试线和1条质控线的位置，间隔6mm ;将金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E对应的特异性捕获抗体JN2011-01，K3，1G7，5F2及1E5稀释到lmg/mL，分别用B1jet Quanti3000喷膜机将A、B、C、D、E对应的捕获抗体喷至测试线(7、6、5、4、3)处；将0.5mg/mL的羊抗鼠IgG 二抗喷至质控线(8)处；37°C烘干2h并切条备用； e、试纸条的组装 将吸水垫(9)粘附在硝酸纤维素膜(10)靠近质控线(8)的一端，将样品垫(1)粘附在硝酸纤维素膜(10)的靠近测试线(3)的另一端，将硝酸纤维素膜(10)固定于PVC底板(11)上，样品垫(1)与测试线(3)之间在硝酸纤维素膜(10)中间设有金标垫；金标垫上设有金标检测抗体(2) ;4°C保藏至使用前。4.权利要求1所述同时检测5种金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E的胶体金试纸条的应用，其特征在于:适用于食品样品的快速同时检测，对5种金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E 的肉眼最低检测限分别为 5ng/mL、5 ng/mL、5 ng/mL、2.5 ng/mL 及 10 ng/mL。
【专利摘要】一种同时检测5种金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E的胶体金试纸条及其制备方法，属于免疫分析技术领域。本发明公开了5种肠毒素夹心ELISA配对抗体的制备及筛选，同时检测5种肠毒素的试纸条及其制备方法。该试纸条由样品垫、喷有5条测试线和1条质控线的硝酸纤维素膜、吸水垫及PVC底板组合而成。5条测试线自前而后分别包被肠毒素E、D、C、B、A对应的捕获抗体，质控线包被羊抗鼠IgG二抗。目标物存在的情况下，金纳米粒子标记的5种肠毒素对应的金标检测抗体分别在相应的测试线与目标物形成夹心结构并显色。该试纸条可实现食品中5种肠毒素的同时检测，且测试方法简单、快速、灵敏、特异性好，对5种肠毒素A、B、C、D、E的肉眼最低检测限分别为5ng/mL、5ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL及10ng/mL。CGMCC No.1086320150519
【IPC分类】G01N21/78, G01N33/577
【公开号】CN105353128
【申请号】CN201510669537
【发明人】匡华, 王文彬, 胥传来, 徐丽广, 马伟, 刘丽强, 吴晓玲, 宋珊珊, 胡拥明
【申请人】江南大学
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年10月16日