22836。
[0045]实施例1
[0046]—种快速测定蓝藻细胞凋亡的方法，具体包括如下步骤:
[0047](1)、藻液样品的培养
[0048]取18个100mL容量瓶分别编号1?18，均加入经过培养基稀释后的蓝藻藻液，通过控制其吸光度，从而使得实验组和对照组的藻细胞个数都尽量保持一致；
[0049]三个藻样为一组，依次加入草甘膦药剂，使每组藻样中草甘膦浓度依次为0、0.2、
l、2、5、10mg/L，以此来诱导蓝藻细胞发生凋亡，随后将其全部放入光照培养箱培养24h。
[0050]所述的培养基为高压灭菌的BG-11。
[0051](2)、样品的预处理
[0052]依次取一定量的上述步骤(1)中培养好的藻液于1.5mL的离心管中，注意确保每管样品中含有1?5 X 105个蓝藻细胞，在4500r/min的转速下离心3min后，再弃去上层的藻液培养基；
[0053]在剩下的每管藻细胞沉淀样品中分别加入200yL的细胞分析缓冲液，重新制成藻细胞悬液。
[0054]然后每管加入2yL的Apopxin?V1let 500磷脂酰丝氨酸染料，在室温条件下进行孵化，即将加好燃料的样品避光保存，静置30?60min。
[0055]最后在用流式细胞仪进行分析前，加入300yL细胞分析缓冲液以增加样品体积。
[0056](3)、使用流式细胞仪分析受试样品的细胞凋亡状况
[0057]将步骤(2)中经过染色、孵化等一系列预处理后的蓝藻藻液样品，用流式细胞仪进行测定。分析流式细胞仪的结果图如图1，利用蓝藻细胞自身在405nm波长激发下产生红色荧光，在发生细胞凋亡时磷脂酰丝氨酸外翻，被Apopxin? V1let 500染料染色产生绿色荧光的特点，通过流式细胞仪定量的测定出凋亡细胞的个数，进而直接可以计算出蓝藻细胞的细胞凋亡率。
[0058]具体对其进行分析比较可知，生长正常的蓝藻细胞表现为红色荧光强、绿色荧光弱，即为流式细胞仪结果图的左上区域;发生凋亡的蓝藻细胞，由于磷酯酰丝氨酸外翻与染料结合，表现为红色荧光较弱、绿色荧光较强，即为流式细胞仪结果图的右下区域；因此在流式细胞仪结果图如图1中每张流式细胞仪结果图的右下区域为表示蓝藻细胞凋亡的区域。
[0059]测定条件:流式细胞仪参数设定为，单次采集细胞总个数为5000;Ex/Em= 405/520，式中Ex为激发波长，Em为发射波长。
[0060]横纵坐标轴分别选择RedFluorescence(RED-HLog)和GreenFluorescence(GRN_HLog)。
[0061](4)、蓝藻细胞凋亡率计算
[0062]根据步骤(3)中流式细胞仪分析得出的图谱经过分析比较，因为本发明中所述的蓝藻带有自荧光现象，自身会发红色荧光，因此正常的活细胞会检测出很强的红色荧光。而出现早期凋亡的蓝藻细胞会出现磷脂酰丝氨酸外翻的现象，被Apopxin? V1let 500染料染色后会在405nm波长处激发出绿色荧光。因此我们分析得出图中右下区域显示的为早期凋亡细胞个数，并按下列公式计算蓝藻细胞早期凋亡率:
[0063]蓝藻细胞早期凋亡率％=Cx/CoX100;
[0064]式中:
[0065]Cx为第X个藻液样品中的早期凋亡细胞个数；
[0066]Co为使用流式细胞仪时设定的每次分析时所收集的细胞个数。
[0067]上述蓝藻细胞凋亡率计算公式中，Co为5000，具体可以根据各自实验中的设定作出相应调整。
[0068]从图1的流式细胞仪结果图中根据上述蓝藻细胞凋亡率的计算公式，可以计算得出藻液样品中草甘膦浓度为0、0.2、1、2、5、10 (mg/L)时，分别对应的细胞凋亡率为3.78、4.42、4.82、5.06、6.50、7.70(%)。可以看出随着作用于蓝藻样品中草甘膦浓度的增大，其细胞凋亡率也明显地出现了递增的趋势，如图2所示。
[0069]综上所述，本发明的一种快速测定蓝藻细胞凋亡的方法，利用蓝藻细胞自身的红色荧光及发生细胞凋亡时磷脂酰丝氨酸被染色产生绿色荧光的特点，通过流式细胞仪定量的测定出凋亡细胞的个数，进而直接可以计算出蓝藻细胞的细胞凋亡率。并且本发明的测定方法结合蓝藻自身特点，比传统的形态学检测法和DNA片段分析法更加方便快捷，适用于大批量的样品测定且其成本远低于，更适合于普遍使用。
[0070]上述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种快速测定蓝藻细胞凋亡率的方法，其特征在于包括如下步骤: 1)利用磷脂酰丝氨酸细胞凋亡染料对待测样品进行染色，将染色处理好的样品在室温下避光静置孵化，然后通过流式细胞仪中的绿色荧光通道在Ex/Em=405/520处对其进行测定； 2)根据蓝藻自身特性与细胞凋亡的特征分析比较流式细胞仪的结果图，得出受测蓝藻样品中的蓝藻细胞凋亡细胞个数，以此计算出整个蓝藻藻样总体的细胞凋亡率。2.如权利要求1所述的一种快速测定蓝藻细胞凋亡的方法，其特征在于:所述的磷脂酰丝氨酸染料为适用于流式细胞仪绿色荧光通道。3.如权利要求1所述的一种快速测定蓝藻细胞凋亡的方法，其特征在于包括如下步骤: 1)一个培养待测蓝藻藻液样品的步骤； 取若干个容量瓶分别加入经过培养基稀释后的蓝藻藻液，通过控制其吸光度，从而使得实验组和对照组的藻细胞个数保持一致； 在每组藻样中依次加入不同浓度的受试物以此来诱导细胞凋亡，放入光照培养箱培养20?30h。 上述样品中，设置未加药品的蓝藻细胞液作为空白对照，且每组样品设置2?4个平行样； 所述的培养基为高压灭菌的BG-11;所述的受试物为除草剂草甘膦； 2)—个样品预处理的步骤； 依次取一定量的上述步骤(1)中培养好的藻液于1.5mL的离心管中，确保每管样品中含有1?5 X 105个蓝藻细胞，在4500r/min的转速下离心2?5min后，再弃去上层的藻液培养基; 在剩下的每管藻细胞沉淀样品中分别加入200yL的细胞分析缓冲液，重新制成藻细胞悬液； 然后每管加入2yL的磷脂酰丝氨酸染料，在室温条件下进行孵化，然后避光保存，静置30?60min; 在用流式细胞仪进行分析前，加入300yL细胞分析缓冲液以增加样品体积； 3)使用流式细胞仪分析受试样品的细胞凋亡状况； 将步骤(2)中经过染色、孵化预处理后的蓝藻藻液样品，用流式细胞仪进行测定，从流式细胞仪的结果图中分析比较，得出表示蓝藻细胞凋亡的区域， 测定条件:Ex/Em=405/520， 横纵坐标轴分别选择Red Fluorescence和Green Fluorescence ； 4)蓝藻细胞凋亡率计算 根据步骤(3)中流式细胞仪分析得出的图谱经过分析比较得出图中显示的早期凋亡细胞个数按下列公式计算蓝藻细胞早期凋亡率: 蓝藻细胞早期凋亡率％ =Cx/Co X 100; 式中: Cx为第x个藻液样品中的早期凋亡细胞个数； Co为使用流式细胞仪时设定的每次分析时所收集的细胞个数。4.如权利要求3所述的一种快速测定蓝藻细胞凋亡的方法，其特征在于:上述蓝藻细胞早期凋亡率计算公式中，Co为5000。5.如权利要求3所述的一种快速测定蓝藻细胞凋亡的方法，其特征在于:所述流式细胞仪的型号为Guava easyCyte5,默克化工技术上海有限公司生产;所用的Apopxin?V1let500磷脂酰丝氨酸染料为美国加州ATT B1quest艾美捷科技有限公司生产的磷脂酰丝氨酸细胞凋亡试剂盒中的组分A，货号为22836。
【专利摘要】本发明公开了一种快速测定蓝藻细胞凋亡的方法，利用磷脂酰丝氨酸细胞凋亡染料对待测样品进行染色，将染色处理好的样品在室温下避光静置孵化，最后通过流式细胞仪中的绿色荧光通道在Ex/Em=405/520处对其进行测定，根据蓝藻自身特性与细胞凋亡的特征分析比较流式细胞仪的结果图，得出受测蓝藻样品中的蓝藻细胞凋亡细胞个数，以此计算出整个蓝藻藻样总体的细胞凋亡率。本发明的快速测定蓝藻细胞凋亡的方法具有步骤简单、操作方便、染料用量少以及测定结果精确度高等优点。
【IPC分类】G01N1/30, G01N15/14, G01N21/64
【公开号】CN105445248
【申请号】CN201510927100
【发明人】叶璟, 周雅, 吴亮, 杜玉苹, 胡晓钧
【申请人】上海应用技术学院
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年12月14日