一种利用麦穗鱼检测水中遗传毒物的方法
【技术领域】
[0001]本发明提供了一种利用麦穗鱼检测水中遗传毒物的方法，属于化学品安全性评价和环境监测领域。
【背景技术】
[0002]遗传毒性测试和评估方法已列入新药研究、环境监测、农药开发、化学物质与食品安全性评价、新型材料研制等涉及人体健康或环境风险评价的规定试验检测项目。由于生物物种具有地域性，使用国际标准模式物种进行环境监测和化学品安全性评价，并不能充分保护我国本土生物。因此，我国新化学物质登记法规中规定，进行新化学物质申报时必须提供在中国境内用中国的供试生物完成的生态毒理学测试数据。对于排水和环境水体进行毒性监测，也非常必要采用本土物种。麦穗鱼(Pseudorasbora parva)属鲤科，麦穗鱼属，在国内分布广泛，是江河、湖泊、池塘等水体中常见的小型鱼类，具有适应性广、繁殖力强、易于培养等特点。目前利用麦穗鱼进行毒性评价主要用于测试急性毒性，或利用麦穗鱼微核实验评价遗传毒性。尚无利用麦穗鱼彗星实验评价遗传毒性的方法。
[0003]彗星实验，即单细胞凝胶电泳实验，是一种检测真核生物细胞DNA损伤的常用方法，可以对遗传毒物引起的DNA损伤进行定性和半定量的测试，与传统的遗传毒性测试方法如微核试验、Ames实验等相比，具有灵敏、快速的优点。人用药品注册技术规定国际协调会议(ICH)2012年修订的药物评价指南中将组织彗星实验纳入遗传毒性评价中。经济合作与发展组织(OECD)已颁布体内碱性彗星试验指南。因此利用彗星实验进行遗传毒性检测具有良好的可行性和应用前景。
【发明内容】
[0004]本发明根据彗星实验用于遗传毒性评价的灵敏、快速、简便的特点，以及化学品安全性评价对于使用本土生物的规定，提出了一种利用中国本土淡水生物麦穗鱼检测水中遗传毒物的方法。
[0005]本发明的技术方案:
[0006]—种利用麦穗鱼检测水中遗传毒物的方法，步骤如下:
[0007](I)试验鱼准备:将麦穗鱼在温度21_23°C、光暗比14h:1Oh曝气水驯养7天;得到平均体长2.6-2.8cm和平均体重0.3-0.5g的麦穗鱼；
[0008](2)设置空白对照组、阳性对照组和待测组水样，暴露处理麦穗鱼;每2L水中暴露5条麦穗鱼，暴露处理前一天停止喂食，暴露期间不喂食；
[0009]所述的空白对照组水样为曝气水；
[0010]所述的阳性对照组水样为用曝气水配制的浓度为0_30mg/L的浓度梯度的重铬酸钾溶液，或用曝气水配制的浓度为0-5yg/L的浓度梯度的4-硝基喹啉-1 -氧化物溶液；
[0011]所述的待测组水样是用曝气水配制的目标化学物溶液、经过过滤的环境水样或其他可溶于水中的环境样品；
[0012](3)将麦穗鱼分别暴露在步骤(2)的三种水样中96h，取出麦穗鱼，冰上解剖取出肝脏组织，用于单细胞凝胶电泳；
[0013]所述的单细胞凝胶电泳步骤如下:
[0014]I)制备单细胞悬浮液:取麦穗鱼肝脏组织，用PBS缓冲液冲洗肝脏组织，4°C条件下加入0.4mL解冻的胰蛋白酶，将肝脏组织分解为单细胞，加入0.SmL杜尔伯科改良伊格尔培养基(DMEM)终止消化，用200目的钢丝网过滤，将滤液进行离心处理，去上清液，加入DMEM，调整悬浮液中细胞密度为16?17个/ml，制得麦穗鱼肝细胞单细胞悬浮液；
[0015]2)制作单细胞电泳胶板:将加热溶化后的0.准熔点琼脂糖快速铺在载玻片上，4°C下冷却凝固，制成第一层胶板;按照体积比3:1将0.35wt %低熔点琼脂糖和单细胞悬浮液混合铺在第一层胶板上，4°C下冷却凝固，制得双层胶板；
[0016]3)裂解细胞:将双层胶板浸入裂解液中，4°C下避光放置1.5h，结束后用蒸馏水冲洗残留裂解液；
[0017]4)DNA解旋:将步骤3)得到的双层胶板浸入碱性缓冲溶液，4°C下避光放置20min;
[0018]5)电泳:将步骤4)得到的双层胶板水平放入电泳槽中，倒入电泳液，电压25V，电流300mA，电泳20min。
[0019](4)染色:单细胞凝胶电泳结束后用蒸馏水冲洗双层胶板，用Tris-HCl缓冲液浸泡双层胶板15min，反复2次;避光瞭干，Gelred染色；
[0020](5)镜检和分析:用显微镜观察经过步骤(4)处理后的细胞状态并拍照；获取图像后，对细胞彗星尾长、DNA含量和尾矩进行统计分析。
[0021]所述的裂解液为2.511101/1^1(:1、0.111101/1^^0了厶、1011111101/1Tris-HCl 和 Iwt %十二烷基肌氨酸钠，调整PH= 10，使用前加Iwt % Triton X-100和1wt % 二甲基亚砜(DMSO)。
[0022]所述的1^8-!1(:1缓冲液的浓度为0.411101/1，？!1为7.5。
[0023]本发明的有益效果:选择中国本土淡水生物麦穗鱼，通过彗星实验对化学品或环境水体进行遗传毒性检测，相比于使用国际标准模式生物，使用本土物种能够更充分评价中国本土生物健康风险；同时用于化学品和实际环境水体的遗传毒性监测，可以更全面评价环境污染对于水生生物的健康风险；用麦穗鱼进行彗星实验评价遗传毒性，相比于用麦穗鱼进行微核试验，更为灵敏、快速。
【附图说明】
[0024]图1为不同浓度K2Cr2O7对麦穗鱼DNA损伤。
[0025]图2为不同浓度4-NQ0对麦穗鱼DNA损伤。
[0026]图3为不同稀释浓度水样对麦穗鱼DNA损伤。
【具体实施方式】
[0027]以下结合附图和技术方案，进一步说明本发明的【具体实施方式】。
[0028]实施例
[0029]采集浑河某断面水样，用玻璃纤维滤膜过滤后，用于麦穗鱼暴露；用重铬酸钾(K2Cr2O7)和4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQ0)作为阳性对照，评价该水样对麦穗鱼的遗传毒性。
[0030]本具体实施例采用如下步骤:
[0031](I)麦穗鱼在实验室内驯养一周，驯养期间死亡率低于5%，暴露前一天停止喂食，选择体长、体重接近的同一批麦穗鱼用于实验；
[0032](2)用曝气一天以上自来水，配制麦穗鱼暴露水样:阳性对照化学物，K2Cr2O7浓度梯度为 2.5mg/L、5mg/L、10mg/L，4-NQ0 浓度梯度为 0.2yg/L、0.5yg/L、lyg/L ；待测环境水样，用玻璃纤维滤膜过滤后，用曝气自来水稀释，浓度梯度60 %、80 %、100 % ;
[0033](3)用空白对照(曝气自来水)、阳性对照和待测水样暴露处理麦穗鱼96h，2L水样中暴露5条麦穗鱼，光暗比14h:10h，温度21-23°C;
[0034](4)暴露结束后，将麦穗鱼置于冰上解剖取肝脏组织；
[0035](5)制作单细胞电泳胶板:取450yL加热溶化后的0.5的％正常熔点琼脂糖，快速铺在载玻片上，4°C下冷却凝固，制成第一层胶板;将450yL 0.35被％低熔点琼脂糖和150yL单细胞悬浮液混合，取10yL混合液铺在第一层胶板上，4°C下冷却凝固，制得双层胶板；
[0036](6)裂解细胞:将步骤(5)得到的双层胶板浸入裂解液中，4°C下避光放置1.5h，结束后用蒸馏水冲洗残留裂解液；
[0037](7)DNA解旋:步骤(6)得到的双层胶板浸入碱性缓冲溶液，4°C下避光放置20min;
[0038](8)电泳:将步骤(7)得到的双层胶板水平放入电泳槽中，倒入电泳液，电压25V，电流300mA，电泳20min;
[0039](9)染色:电泳结束后用蒸馏水冲洗胶板，用T r i s - H CI缓冲液，浸泡双层胶板15min，反复2次;避光瞭干，Gelred染色；
[0040](10)镜检和分析:用荧光倒置显微镜，观察细胞状态并拍照；获取图像后，对细胞彗星尾长、DNA含量和尾矩进行统计分析。
[0041 ] 结果说明:图1和图2分别是用麦穗鱼彗星实验评价1(2&207和4-NQ0的遗传毒性，在K2Cr2O7浓度为5mg/L和4-NQ0浓度为0.5yg/L时检测出显著的遗传毒性效应。图3是用麦穗鱼彗星实验检测浑河某断面水样遗传毒性，该水样在稀释浓度为60 %时对麦穗鱼产生了显著的遗传毒性。综上，麦穗鱼进行彗星实验能快速、灵敏的评价化学品的遗传毒性以及监测环境样品的遗传毒性。
【主权项】
1.一种利用麦穗鱼检测水中遗传毒物的方法，其特征在于，步骤如下: (1)试验鱼准备:将麦穗鱼在温度21-23°c、光暗比14h:1Oh曝气水驯养7天，得到平均体长2.6-2.8cm和平均体重0.3-0.5g的麦穗鱼； (2)设置空白对照组水样、阳性对照组水样和待测组水样，暴露处理麦穗鱼；每2L水中暴露5条麦糖鱼，暴露处理如一天停止喂食，暴露期间不喂食； 所述的空白对照组水样为曝气水； 所述的阳性对照组水样为用曝气水配制的浓度为0_30mg/L的浓度梯度的重铬酸钾溶液，或用曝气水配制的浓度为0-5yg/L的浓度梯度的4-硝基喹啉-1 -氧化物溶液； 所述的待测组水样是用曝气水配制的目标化学物溶液、经过过滤的环境水样或其他溶于水中的环境样品； (3)将麦穗鱼分别暴露在步骤(2)的三种水样中96h，取出麦穗鱼，冰上解剖取出肝脏组织，用于单细胞凝胶电泳； (4)染色:单细胞凝胶电泳结束后用蒸馏水冲洗双层胶板，用Tris-HCl缓冲液浸泡双层胶板15min，反复2次;避光瞭干，Gelred染色； (5)镜检和分析:用显微镜观察经过步骤(4)处理后的细胞状态并拍照；获取图像后，对细胞彗星尾长、DNA含量和尾矩统计分析。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单细胞凝胶电泳步骤如下: 1)制备单细胞悬浮液:取麦穗鱼肝脏组织，用PBS缓冲液冲洗肝脏组织，4°C条件下加入0.4mL解冻的胰蛋白酶，将肝脏组织分解为单细胞，加入0.SmL杜尔伯科改良伊格尔培养基终止消化，用200目的钢丝网过滤，将滤液进行离心处理，去上清液，加入DMEM，调整悬浮液中细胞密度为16?17个/ml，制得麦穗鱼肝细胞单细胞悬浮液； 2)制作单细胞电泳胶板:将加热溶化后的0.准熔点琼脂糖快速铺在载玻片上，4°C下冷却凝固，制成第一层胶板;按照体积比3:1将0.35wt %低熔点琼脂糖和单细胞悬浮液混合铺在第一层胶板上，4°C下冷却凝固，制得双层胶板； 3)裂解细胞:将双层胶板浸入裂解液中，4°C下避光放置1.5h，结束后用蒸馏水冲洗残留裂解液； 4 )DNA解旋:将步骤3)得到的双层胶板浸入碱性缓冲溶液，4°C下避光放置20min; 5)电泳:将步骤4)得到的双层胶板水平放入电泳槽中，倒入电泳液，电压25V，电流300mA，电泳20min。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的Tris-HCl缓冲液的浓度为0.4mol/L，pHS7.5。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的裂解液为2.5moI/LNaCl、0.1mo I/LNa2EDTA、10mmol/L Tris_HCl和Iwt %十二烧基肌氨酸钠，调整pH = 10，使用前加Iwt %Triton X_10(^P10wt%DMS0。
【专利摘要】本发明提供了一种利用麦穗鱼检测水中遗传毒物的方法，属于化学品安全性评价和环境监测领域。包括步骤如下：(1)用待测水样暴露处理麦穗鱼；(2)取暴露处理后的麦穗鱼肝细胞进行单细胞凝胶电泳实验，检测并统计细胞彗星尾长、DNA含量和尾矩，并绘制剂量-效应曲线。通过与空白对照和阳性对照的比较，以及剂量-效应关系，判断受试样品的遗传毒性。本发明的检测方法可以灵敏、快速判断化学物的遗传毒性,并为化学品遗传毒性评价和环境遗传毒性监测提供了一种基于我国本土物种的检测方法。
【IPC分类】G01N33/18, G01N21/84
【公开号】CN105510543
【申请号】CN201510847527
【发明人】刘薇, 张洲, 张新, 赵璐璐, 杨京亚
【申请人】大连理工大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年11月27日