一种基于害虫特定气味受体筛选高效驱避剂的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及害虫防治领域中筛选害虫驱避剂的方法，特别是涉及一种基于蚜虫特 定气味受体筛选高效驱避剂的方法。
【背景技术】
[0002] 蚜虫为刺吸式口器害虫，通过直接吸食植物汁液和传播植物病毒对农作物产生严 重的危害。长期以来，蚜虫的防治一直以化学防治为主，蚜虫对有机氯、有机磷、氨基甲酸 酯、拟除虫菊酯、新烟碱类等多种杀虫剂产生了抗性。另外，蚜虫具有保守的报警机制，当其 遭受到天敌捕食或寄生等危险时，会从腹部后侧的腹管释放对周围其它个体有报警作用的 小液滴，这种甘油三酯小液滴中含有蚜虫报警信息素的主要成分。蚜虫的报警信息素易挥 发，附近的其它个体感知后会产生相应的趋避行为，如:逃离这株植物或直接从植物上掉 落。
[0003] 使用气相色谱质谱仪分析23种蚜虫被碾碎后释放的报警信息素主要成分，结果显 示，16种蚜虫被碾碎后释放的报警信息素的唯一或主要成分为(反)-β_法尼烯，5种蚜虫被 碾碎后释放的报警信息素中含有少量(反)-β_法尼烯，2种蚜虫被碾碎后释放的报警信息素 中无(反)-β_法尼烯。（反)-β_法尼烯作为豌豆蚜和棉蚜报警信息素的唯一成分，在其它各 种蚜虫保守的报警机制中也起到了重要的作用。
[0004] 利用蚜虫保守的报警机制来防治蚜虫可减缓化学防治对环境的污染和蚜虫抗药 性的产生，但由于蚜虫自身释放的(反)-β_法尼烯气味分子在空气容易被氧化，将其直接应 用发展为控制蚜虫的驱避剂有一定的难度，因此筛选得到其它高效且稳定的驱避剂补充 (反)-β_法尼烯因氧化而损失的趋避效果或者直接替代(反)-β_法尼烯应用于蚜虫防治使 其产生趋避的行为反应，在利用驱避剂进行害虫防治的过程中是必要的。因此，寻找简便可 行的筛选高效驱避剂的方法也具有重要意义。
[0005] 参与昆虫感知外界气味分子的蛋白种类有很多，其中气味受体是其中重要的一 类。特定的气味分子会激活特定的气味受体，进而昆虫会产生相应的行为。昆虫能够通过特 定的气味受体感知对其有趋避作用的气味分子，从而做出相应的趋避行为反应。因此，利用 已知能对姐虫产生趋避行为的（反)-β_法尼稀筛选得到能够感知此气味的特定气味受体， 然后再利用该特定气味受体，筛选能够激活该特定气味受体的其它气味，作为对昆虫可能 存在趋避效应的候选驱避剂，因此寻找这样一种可行的筛选昆虫驱避剂的方法，将可以实 现环境友好，经济有效的绿色防止途径来控制害虫的危害。
【发明内容】
[0006] 本发明提供一种基于蚜虫特定气味受体筛选高效驱避剂的方法，利用生物信息学 软件进一步分析已预测得到的豌豆蚜和棉蚜的气味受体，利用氨基酸一致性比对筛选可感 知报警信息素(反)-β_法尼烯的候选特定气味受体，通过爪蟾卵母细胞异源表达系统，应用 双电极电压钳技术筛选能够被(反)-β_法尼烯激活的特定气味受体;然后利用RNA干扰技术 将筛选得到的气味受体在豌豆蚜体内进行基因沉默，结合豌豆蚜行为学实验验证所得到的 该气味受体为感知(反)-β-法尼稀的特定气味受体。
[0007] 一种基于害虫特定气味受体筛选高效驱避剂的方法，包括如下步骤，
[0008] ①利用在所述害虫的同物种基因组中预测得到的气味受体序列，利用氨基酸一致 性比对结果进行排序，选取高同源性的气味受体为候选特定气味受体，克隆得到候选特定 气味受体的全长序列，
[0009] ②在爪蟾卵母细胞异源表达系统中表达，
[0010] ③使用双电极电压钳技术筛选对所述害虫的报警信息素或趋避性气味气体成分 有反应的特定气味受体，
[0011] ④使用双电极电压钳技术筛选可激活害虫特定气味受体的气味物质。
[0012] 所述害虫为蚜虫。
[0013] 所述害虫的同物种为豌豆蚜和棉蚜，所述报警信息素成分为(反)-β-法尼烯。
[0014] 所述步骤③中筛选得到的豌豆蚜气味受体Apis0R5和棉蚜气味受体Agos0R5。
[0015] 所述方法还包括步骤⑤，所述步骤⑤为通过Y型管行为学实验并计算趋避强度来 检测驱避剂的趋避强度，同时筛选到最佳的可激活害虫特定气味受体的气味物质。
[0016] 所述害虫为蚜虫，所述气味物质为乙酸香叶酯。
[0017] 所述方法还包括步骤③后对筛选到的特定气味受体的验证步骤。
[0018] 所述验证步骤包括通过RNA干扰技术对该受体基因进行害虫体内沉默和/或利用Y 型管行为学实验验证该筛选到的特定气味受体为所述害虫的报警信息素成分的特定气味 受体。
[0019] 本发明以选定的特定气味受体，Apis0R5和Agos0R5为例，利用爪蟾卵母细胞异源 表达系统结合双电极电压钳技术筛选能够激活该受体的气味，然后通过豌豆蚜和棉蚜Y型 管行为学实验验证上述筛选得到的气味对蚜虫的趋避效应。该方法为筛选新的昆虫驱避剂 提供了新的技术手段和平台，为有效防治蚜虫，乃至其它害虫提供了新的技术资源和环境 友好的新的方法。
[0020] 本发明优点是：
[0021] 1.本发明中筛选得到特定气味受体可作为标准，利用同源性，可找到其它种类蚜 虫中的(反)-β_法尼烯的特定气味受体。
[0022] 2.本发明具有普适性，可应用于大规模筛选蚜虫的驱避剂。
[0023] 3.本发明可定量比较蚜虫驱避剂的趋避强度。
[0024] 本发明方法虽然是基于蚜虫驱避剂的筛选，但可适用于任意害虫驱避剂的筛选。
【附图说明】
[0025] 图1为豌豆蚜和棉蚜候选特定气味受体同源树，
[0026] 图2为Apis0R5/0rco和Apis0R5/0rco共表达的爪蟾卵母细胞对(反)-β-法尼烯刺 激的反应图;Α为Apis0R5/0rco和Apis0R5/0rco共表达的爪蟾卵母细胞对(反)-β-法尼稀刺 激的反应轨迹图；Β为Apis0R5/0rco和Apis0R5/0rco共表达的爪蟾卵母细胞对(反)-β-法尼 烯刺激的反应电流值图，
[0027] 图3为Apis0R5/0rco和Apis0R5/0rco共表达的爪蟾卵母细胞对梯度浓度(反)-β- 法尼烯刺激的反应轨迹图，
[0028] 图4为Apis0R5/0rco和Apis0R5/0rco共表达的爪蟾卵母细胞对梯度浓度（反)-β- 法尼烯刺激的剂量反应曲线图，
[0029]图5为RNA干扰Apis0R5基因后Υ型管行为学实验结果图，
[0030] 图6为Apis0R5/0rco共表达的爪蟾卵母细胞的气味反应谱图，
[0031]图7为豌豆蚜对(反)-β_法尼烯和乙酸香叶酯行为学反应图，
[0032]图8为棉蚜对(反)-β_法尼烯和乙酸香叶酯行为学反应图，
[0033]图9为(反)-β_法尼烯和乙酸香叶酯对豌豆蚜和棉蚜趋避强度图。
【具体实施方式】
[0034] 下面通过具体实施例进一步说明本发明。以下实施例用于说明本发明，但并不用 来限制本发明的保护范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条 件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0035] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实 验材料，如无特殊说明，均为市售常规生化试剂。
[0036] 实例1蚜虫气味受体基因的分析与克隆
[0037] 1.蚜虫气味受体基因的分析
[0038] 使用DNAMAN8.0软件比对已预测得到的豌豆蚜和棉蚜气味受体(豌豆蚜气味受体 预测：Smadja，C.，Shi，P.，Butlin，R.K.&Robertson，Η·Μ·Large gene family expansions and adaptive evolution for odorant and gustatory receptors in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum.Mol Biol Evol 26,2073-2086,doi:10.1093/molbev/mspl16 (2009)棉蚜气味受体预测：Cao，D.，Liu，Y.，Walker，W.B.，Li，J.&Wang，G .Molecular characterization of the Aphis gossypii olfactory receptor gene families.PLoS One 9，elOl 187，doi : 10 · 1371/journal .pone ·0101187(2014) ·)的氨基酸一致性，按照同源 性从高到低排序后，选择氨基酸一致性高于65%的气味受体，作为候选的特定气味受体，并 构建同源树，如图1所示。
[0039] 2.蚜虫的饲养与组织收集
[0040]豌豆蚜是在中国农业科学院植物保护研究所使用土培蚕豆饲养的，饲养温度为20 ±2°C，光周期为16:8,相对湿度为70±5%。取3,4龄若虫及成虫蚜触角置于-70°C冰箱待 用。
[0041] 棉蚜是在中国农业科学院植物保护研究所使用土培棉花饲养的，饲养温度为25± 1°C，光周期为14:10,相对湿度为60 ±5%。取3，4龄若虫及成虫蚜触角置于-70°c冰箱待用。
[0042] 3.RNA 的提取
[0043] RNA提取的全部过程均在无 RNA酶条件下进行。整个提取步骤如下所示：
[0044] 1)从-70°C冰箱取出保存的组织，倒入匀浆器中并加入lmL Trizol试剂，充分研磨 组织，将研磨好的组织溶液转移到置于冰上的无 RNA酶的1.5mL离心管中。
[0045] 2)4°C，12000rpm 离心 10min。
[0046] 3)将上清转移到新的无 RNA酶的1.5mL离心管中。为了充分裂解核蛋白复合体，室 温放置5min。
[0047] 4)向离心管中加入0.2mL氯仿，剧烈震荡15s，室温静置2-3min。
[0048