] 5)4°C，12000rpm离心 15min。
[0049] 6)将上层水相转移到新的无 RNA酶的1.5mL离心管中，向离心管中加入0.5mL异丙 醇，缓慢混匀后，室温放置1 〇min。
[0050] 7)4°C，12000rpm 离心 lOmin。
[00511 8)吸弃上清，向离心管中加入lmL75 %乙醇，缓慢混匀。
[0052] 9)4°C，7500rpm离心 5min。
[0053] 10)吸弃上清，室温干燥lOmin至无明显水痕。
[0054] 11)加入10-20yL DEPC水(根据沉淀量决定)溶解沉淀，55-60°C孵育1 Omin。
[0055] 4 · cDNA第一条链合成
[0056] 实验在无 RNA酶条件下，实验步骤按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit的说明书操作。
[0057] 1)在无 RNA酶的 1 · 5mL离心管中加入：总RNA Ο · lng_5yg，lyL oligo(dT) 18primer， 加 RNas e-fr ee水补至12yL，缓慢混匀后离心。
[0058] 2)65。〇温育511^11后，立即置于冰上。
[0059] 3)依次加入：4yL 5XReaction缓冲液，lyL RiboLock RNase InhibitoiOOu/y L)，2yL lOmM dNTP Mix，lyL RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase(200u/yL)使总 体积达到20yL，缓慢混匀后离心。
[0060] 4)42°C温育lh后，70°C温育5min，保存于-20°c冰箱。
[0061 ] 5.候选特定气味受体的扩增及测序
[0062]依据氨基酸序列一致性比对结果进行排序，一致性高于65 %的组合作为候选特定 气味受体，有15组候选特定气味受体。根据预测的序列全长，设计上下游引物，扩增候选特 定气味受体的全长序列。
[0063] 上述实验中使用的部分引物列表如下：
[0064] ApisOrcoF:ATGGGTTATAAGAAAGATGGTCTTAT
[0065] ApisOrcoR:TTATTTAAGCTGCACCAAAACC
[0066] Apis0R5F:ATGCAACGCATAGACACCATCA
[0067] Apis0R5R:TTATGACAACTTGTGAGGTTTTATTGTT
[0068] Agos0R5F:ATGCCGCGCATAGACGCT
[0069] Agos0R5R:TTACGACATCTTATGAGGTTTTATAGCTTC
[0070] PCR反应体系为：2yL cDNA作为模版，0.25yL primeSTAR HS DNA polymerase，5yL 5 X PrimeSTAR缓冲液（加 Mg2+)，2yL dNTP mixture(0 · 25mM)，上下游引物（10μΜ)各0 · 5yL， 加灭菌超纯水至25μΙ^ΡΟ?反应条件为：94°C5min预热变性，98°C10s、55°C15s、72°C1.5min 进行35个循环，72°C延伸lOmin。
[0071 ] PCR产物用1 %琼脂糖凝胶进行检测，切下目的条带处的凝胶放入1.5mL离心管中， 使用全式金琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收(按照试剂盒说明书操作），将回收到的PCR产 物连接到pEASY-Blunt载体上（按照pEASY-Blunt载体试剂盒说明书操作），连接后转入 Transl-Tl化学感受态细胞中（按照试剂盒说明书操作）。挑取8个白色的单克隆菌落，用上 述引物进行PCR验证，挑取PCR验证也为阳性结果的菌落保种，扩大培养后进行测序。正反向 测序结果使用DNAMAN软件进行拼接、比对，选择具有正确开放阅读框的克隆进行下一步的 实验。
[0072] 克隆得到候选特定气味受体，分别为Apis0rco_Agos0rco、Apis0R2-Agos0R2、 Apis0R4-Agos0R4、Apis0R5-Agos0R5、Apis0R10-Agos0R10、Apis0R17_Agos0R17、Apis0R20-Agos0R20、Apis0R23-Agos0R23、Apis0R25-Agos0R25、Apis0R31_Agos0R31、Apis0R37_ Agos0R37、Apis0R38-Agos0R38、Apis0R39-Agos0R39、Apis0R42_Agos0R42、Apis0R43-Agos0R43〇
[0073] 实例2爪蟾卵母细胞异源表达系统中表达气味受体
[0074]选择2个表达载体上合适的酶切位点且测序正确的气味受体序列全长中无选择的 酶切位点。上游引物为保护碱基(TCA)+选择的酶切位点+Kozak序列(GCCACC) +引物序列，下 游引物为保护碱基(TCA)+选择的酶切位点+引物序列。
[0075] 上述实验中使用的部分引物列表如下：
[0076] ApisOrcoF: TCAKCTAGT^CCACCATGGGTTATAAGAAAGATGGTC (Spe I)
[0077] ApisOrcoR: TC/\|CTC(：iA(：i|'TTATTTAAGCTGCACCAAAA(XhoI)
[0078] Apis0R5F: TCAAGATCT'|(；CCACCATGCAACGCATAGACACCAT(Bgl Π )
[0079] Apis0R5R: TCA|GCATGC|TTATGACAACTTGTGAGGTTTTATT( SphI)
[0080] Ago s0R5R: TCA|AA〇CTI]gCCACCATGCCGCGCATAGACGC (Hi nd ΙΠ )
[0081 ] Agos0R5F: TCA1aCTAGT[TTACGACATCTTATGAGGTTTTATAGCT (Spe I)
[0082] PCR反应体系为：2yL cDNA作为模版，0.25yL primeSTAR HS DNA polymerase，5yL 5 X PrimeSTAR缓冲液（加 Mg2+)，2yL dNTP mixture(0 · 25mM)，上下游引物（10μΜ)各0 · 5yL， 加灭菌超纯水至25μΙ^ΡΟ?反应条件为：94°C5min预热变性，98°C10s、55°C15s、72°C1.5min 进行35个循环，72°C延伸10min。
[0083] PCR产物用1 %琼脂糖凝胶进行检测，切下目的条带处的凝胶放入1.5mL离心管中， 用全式金琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收(按照试剂盒说明书操作），将回收到的PCR产物 和pT7Ts载体，先进行双酶切操作后再进行连接反应。连接体系为6yL双酶切过的气味受体 基因片段、lyL双酶切过的pT7Ts载体、2yL10XT4Ligase缓冲液和lyL的T4Ligase，Ligase， 22°C连接2h后，转入Transl-Tl化学感受态细胞中（按照试剂盒说明书操作）。挑取8个白色 的单克隆菌落进行PCR验证，挑取PCR验证也为阳性结果的菌落保种，扩大培养后进行测序。 正反向测序结果使用DNAMAN软件进行拼接、比对，选择具有正确开放阅读框的克隆进行下 一步的实验。
[0084] 选取测序正确的保种菌液扩大培养后提取质粒，选取载体上有但序列全长上没有 的酶切位点进行单酶切，酶切体系和反应条件按照相应酶的说明书操作，酶切产物用1%琼 脂糖凝胶进行检测，确保完全切开。
[0085] 酚氯仿抽提线性化DNA模版步骤如下：
[0086] 1)在线性化质粒体系中加灭菌超纯水至100此，然后加入100yL酚：氯仿：异戊醇 (25:24:1)，震荡15s，充分混匀。
[0087] 2)常温，12000rpm 离心 lOmin。
[0088] 3)将上清小心吸取至干净的1 · 5mL离心管中后，加入Ο · 5yLGenElute LPA，10yL3M NaAc (pH=5 · 2)，200yL 100 % 乙醇，缓慢混匀，-20°C沉淀2h。
[0089] 4)取出冷冻样品，4°C，14000rpm 离心 30min。
[0090] 5)吸弃上清后，加入lmL 80%乙醇，缓慢混匀。
[0091] 6)4°C，14000rpm 离心 5min。
[0092] 7)小心吸弃上清后，风干，根据沉淀量加水稀释，电泳检测酚氯仿抽提质量。
[0093]在电泳检测正确的基础上，进行cRNA合成，详细实验步骤为：
[0094] 1)在无 RNA酶的 1.5mL离心管中依次加入 10yL 2XNTP/CAP、2yL lOXReaction缓 冲液、6yL酚氯仿抽提好的线性化模版和2yL T7 Enzyme mix，震荡混匀离心，37°C温育2h。
[0095] 2)向体系中加入30yL RNase-free水和30yL的氯化锂溶液，4°C静置过夜。
[0096] 3)4°C，14000rpm 离心 30min。
[0097] 4)吸弃上清，加入lmL 70%乙醇，缓慢混匀。
[0098] 5)4°C，14000rpm 离心 5min。
[0099] 6)小心吸弃上清，风干沉淀，根据沉淀量加水稀释，充分混匀。
[0100] 7)取lyL样品与3yL无核酸酶水充分混匀，2yL用于电泳检测，2yL用于测定浓度。
[0101] 8)剩余的样品置于70°C温育5min，迅速置于冰上冷却。
[0102] 9)依据测定的浓度加 RNase-free水稀释到cRNA浓度为2yg/yL，存放于-70°C冰箱。
[0103] 10)挑选健康成熟的爪蟾卵母细胞以27.6nL的体积进行cRNA注射，放于18°C恒温 培养箱中培养3天。
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