配置
[0034] 首先将每个氨基酸标准品浓度分别配制为约2mg/mL (19种氨基酸见表2)，然后每 个标准品取等体积混合，配置成浓度为IOOy g/mL的氨基酸标准品混合溶液，作为母液用 于胆存（-2CTC )。首先，配置浓度为5 U g/mL氨基酸标准品混合物，分装为2份，各50 U以 分别用于6d-丹礙醜氯和丹礙醜氯标记；其次，对氨基酸标准品混合物作线性稀释，浓度包 括 1. 25, 2. 5, 5,10, 20, lOOng/mL，1，5,10, 20, 50,100 U g/mL。各浓度下分别取 50 U L，用于 衍生来作线性评价；配置浓度为50化g/mL的标准品混合物，用作丹醜化及LC-MS分析的日 内精密度（n = 6)和日间精密度（n = 6*3)考察。
[0035] 4)标样混合溶液或提取液衍生化
[0036] 衍生反应中，先向50 U L标样混合溶液或细胞提取液中加入50 U LO. 5M碳酸钢 /碳酸氨钢缓冲溶液，再加入50 U L 5mg/mL丹礙醜氯后，将溶液充分润旋混合。混合物在 6(TC，16化pm条件下反应1小时后，加入30 U L 0. 5M 了胺水溶液，相同条件下反应半小时 W终止丹醜化反应。在13, 000巧m下离必IOmin,上清即可用于LC-MS分析。
[0037] 5) LC-MS 分析
[0038] 色谱分离义用 5cm 服S T3 柱化 Imm 内径，1. 7 y m 粒径）（Waters, Milford, MA)， 同时使用CS预柱（Waters, Milford, MA)进行柱保护。进样量为5化.柱温设定为50°C . 流动相A为0. 1 %甲酸/水（v/v)，流动相B为纯己腊。液相洗脱梯度为；0-lmin，2% B ; l-2min线性升至20 % B,维持0. 5min ;在5min和6min，相继升至55 % B和60 % B, Smin处 升至100% B并维持Imin.单次样品运行时间为12min，其中包括预平衡的3min.流动相流 速为0. 3血/min.
[0039] MS在正离子模式下进行信号采集，质荷比扫描范围为200-1000道尔顿值a)。质谱 分辨率设为15K。离子源参数设置如下：銷气和辅助气流速分别为35和5个单位。！喷雾 电压和毛细管电压分别为4. 5kV和49V ;毛细管温度为35(TC ;离子传输管电压设为100V.
[0040] 6)数据处理
[0041] 原始数据导入软件Seive进行峰匹配，参数设置如下：m/z窗口设为IOppm ;保留 时间窗口为Imin ;最大的峰个数设为1000 ;最小峰强度阔为1000.其他参数为默认值。在 上述自动峰匹配中，同时对目标氨基酸进行祀向提取。祀向提取时峰的起止时间设为保留 时间减加〇.5min.所得的化合物色谱峰面积导出至Excel中用于后续分析。
[0042] 6. 1氨基和酪居基化合物的丹醜化
[0043] 取两份浓度为5 U g/mL氨基酸标准品混合物，分别用6Cl-丹礙醜氯和丹礙醜氯标 记，将気代和非気代丹礙醜氯标记的氨基酸混合物等量混合后进样分析。成对峰的质量差 值为6.03抓曰，保留时间差异为6-lOs，图2显示了苏氨酸灯虹）的成对峰。化合物的 6d-标 记形式比其丹礙醜氯标记形式在液相上早洗脱出来，核对MS模式可W确认丹醜化反应的 发生。类似地，对细胞提取物作了同样处理，W辅助鉴定胞内含氨基或酪居基的代谢物。除 20种常见氨基酸外，在96孔板培养的细胞提取物中初步鉴定了 31种含氨基或酪居基的代 谢物（表1)。
[0044] 对衍生化方法和LC-MS分析进行线性、日内精密度和日间精密度考察；对氨基酸 标准品混合物的线性稀释溶液丹醜化后进行液相色谱-质谱分析。衍生化方法线性考察结 果如下；19个氨基酸混标衍生的线性回归系数为0. 983-0. 998,线性范围在3-4个数量级 (表 2)。
[0045] 对浓度为50化g/mL的标准品混合物，作丹醜化及LC-MS分析的日内精密度（n = 6)和日间精密度（n = 6*3)考察。日内精密度结果为；18个氨基酸（leu和lie在色谱上 未分离，合并计算）的RSD范围为1.6%-10. 1 %，Lys的RSD较大为21. 6%，19个氨基酸 平均RSD为5. 1%。日间精密度结果；18个氨基酸的RSD为7. 1% -18. 5%，Tyr的RSD为 28. 6 %，19个氨基酸平均RSD为11. 9 %。
[0046] 6. 2高通量细胞预处理方法
[0047] 在4)，5)中稳健的丹醜化及LC-MS分析基础上，我们对96孔板培养细胞的高通量 预处理方法，即4°C下静置提取法，进行了评价，包括提取效率的比较和重复性考察。为了评 价该方法的提取效率，分别利用4°C下静置提取方法和冻融-超声提取方法对平行接种于 两块96孔板中的化pG2细胞（n = 12)进行胞内氨基酸提取。
[0048] 具体方法如下：分别在两块96孔板上平行接种化pG2细胞。对第一块96孔板中 生长的细胞（接种方法及培养条件与同1)中所述）先用200 U L冰冷PBS洗H次，迅速加入 50y L 21 ;79(v/v)，甲醇/水（4°C)对细胞进行代谢浑灭。然后，迅速加入50y L 80%的甲 醇水溶液，4°C下静置提取30min.第二块孔板中的细胞用冻融-超声法提取，即先用200 U L 冰冷PBS洗板H次，加入50 U L体积比为21 ;79的甲醇/水（4°C )进行代谢浑灭，于-8(TC 及室温下反复冻融H次（每个冻融循环为-8(TC下冷冻lOmin，随即室温溶解lOmin)，再 加入50 U L 80%的甲醇/水，继续在冰水浴中超声提取30min (n = 12)。两种方法的氨基 酸响应和代谢组总峰面积无显著差异（图3)，说明二者具有相同的提取效率。而在此同等 提取效率下，我们提出的4°C静置提取方法更为简便易行。因此推荐用体积比为1:1，甲醇 /水（4°C )进行一步浑灭和提取。6个复孔中的化pG2细胞衍生溶液中H个同位素内标 Ala-d4, Va^dS和T巧-d5,相对标准偏差为：4. 4%，3. 4%和3. 0%。证明了该预处理方法 具有很好的重复性。
[0049] 6. 3方法分析特性的评价
[0050] 进一步对96孔板接种的化pG2细胞的浑灭、提取、衍生化和LC-MS分析全过程的 分析精度和回收率进行整体考察。为评价整个分析过程，包括96孔板细胞接种、生长、细胞 预处理、丹醜化过程和LC-MS分析的精度，在6个复孔中评价了批内变异系数。为评价提取 的回收率，在提取前，各取10 U L浓度分别为0. 5, 5和50 U g/mL同位素标记的氨基酸混合 物（Ala-d4, Va^d8和T巧-巧加入至IOOiiL不含同位素内标的提取液中（体积比为1:1的 甲醇/水直接用于浑灭和提取）（n = 4);在提取后，将5 U L上述同位素标记的氨基酸混合 物加入至细胞提取物的上清中。低化05 U g/mL)、中（0. 5 U g/mL)和高浓度巧U g/mL)下 测定H个氨基酸的回收率。除特殊说明外，各步骤中的具体实验方法参见实施例1中1)、 2)、4)、5)和 6)。
[0051] 整个过程的分析精度为在19个检测到的胞内氨基酸中，有14个氨基酸RSD<10%， 2 个氨基酸 RSD 为 10% -20%，Gin, Arg 和 Lys 的 RSD 分别为 20. 6%，23. 5%和 33. 2%。 低化05U g/mL)、中（0. 5y g/mL)和高浓度巧U g/mL)下H个氨基酸的回收率分别为： 102. 2-106. 3%，89. 7-95. 7%和 97. 2-99. 0%。
[0052] 表1从96孔板培养细胞的胞内代谢物中鉴定出的其他31个含氨基或酪居基的化 合物。
[0053] 煤留时~~~~ 化合物 巧（mill) 质何比 (m/z) 4.73 42乂 1476 N-acety Idopami ne 6.26 363.1373 2-Pyrrolidineacetic acid 3.23 359.0725 Taurine;' 6.41 372.0897 Salicylic acicf 7.46 358.1106 3-Methylcatechol 5.24 363.21 Octylamine^' 5.23 422.2106 7'8-Diaminononanoate 1.76 646.1898 N6-Carbamoyl-L-threonyladen O sin 己 3.6 394.1794 N(6)-Mel;hyllysine 3.86 399.1038 MeAionine sul化xide 6.79 413.153 Salsolinol 5.71 39 乂 1852 Immepip 4.22 555.1575 L-L-Homoglutathione 2.8 493.1036 Glucosamine 6-phosphate" 3.42 355.078 cysteine。 3.8 409.1536 Citrullin 护 6.58 428.1 拍 B山yl salicylate.: 1.75 78化 1975 Biochanin A 7-(6-methyimalonylglucoside) 5.14 337.122 Aminob山yHe acid;' 6.54 307.1109 Aminoacetxrne 3.93 400.1074 3-Methylxandiine 2.84 387.0671 3-Sulfinoalanine 4.42 30乂 128 l-Aminopropan〇r' 7.49 321.1636 2-MeAylbiuylamine 6.92 37乂 1683 2-amino-heptanoic acid 4.07 383.1035 (3-Nitroamin