o)alanine 5.78 363.137 Pipecolicacid;'' 2.91 449.1135 Glyceryiphosphorylethanoiami ne 2.9] 403.06巧 Cysteic acid:' 5.64 457.1425 Acetyl-L-tyrosine" 4.S 456.15S7_4-aminohippurate_
[0054] a鉴定结果用化学标准品验证过的化合物。
[00巧]表2丹醜化衍生氨基酸的线性响应和精密度。
[0057]
[00则 实施例2
[0059] 脂肪酸干预的化pG2细胞胞内氨基酸代谢轮廓分析：
[0060] 1)胎pG2细胞培养和脂肪酸干预
[0061] 在175cm2的细胞培养瓶中贴壁培养化pG2细胞；给予10% FBS的DMEM高糖培养 基，并在37°C，5% C02的恒定条件下令细胞汇合生长至60-70%。
[0062] 用膜蛋白酶消化细胞，细胞重悬于10% FBS的DMEM培养基中。进行细胞计数，制 备密度为2 X IO4细胞/毫升的细胞悬液用于接种96孔板。
[0063] 在96孔板中，每孔接种100 U L上述化pG2细胞悬液（悬浮液用10 % FBS的DMEM 培养基配置而成），并保持在37C及5% C02的条件下培养2地。
[0064] 细胞生长24h后，对其进行脂肪酸干预。施加的脂肪酸为踪搁酸（PA, C 16:0)，踪 搁油酸（P0A，C 16:1)及二者联合。脂肪酸干预的方法如下；PA首先在7(TC下用己醇溶解， 然后加入至5% BSA中，终浓度为2mM，超声Imin,在55°C下赔育30min. POA首先用己醇稀 释，然后加入至5%654中，终浓度为1.21111，在421：下赔育15111111.将上述脂肪酸-85八溶 液用0. 22 U M无菌滤膜过滤，再用10% FBS-DMEM培养基稀释。细胞分别暴露于终浓度为 100 U M和60 U M的PA和POA及二者联合溶液。对照组细胞培养基中己醇浓度为0. 005 % .
[0065] 2)基于96孔板的细胞预处理
[0066] 2. 1细胞浑灭和胞内代谢物提取
[0067] 脂肪酸干预4化后，96孔板每一孔中生长的细胞先用200 U L冰冷PBS洗H次，迅 速加入50 U L 21 ;79 (v/v)，甲醇/水（4°C )对细胞进行代谢浑灭。再迅速加入50 U L 80% 的甲醇水溶液，其中含浓度为0. 5 U g/mL同位素内标Ala-d4, Va^d8和化p-d5,4°C下静置提 取30min.将提取混合物离必后，取50 U L上层清液用于衍生。
[0068] 2. 2提取液衍生化
[0069] 衍生反应中，先向50y L提取物中加入等体积的0. 5M碳酸钢/碳酸氨钢缓冲溶 液，再加入50 y L 5mg/mL丹礙醜氯后，将溶液充分润旋混合。混合物在60°C，16化pm条件 下反应1小时后，加入30 U L 0. 5M 了胺水溶液，相同条件下反应半小时W终止丹醜化反应。 在13, 000巧m下离必IOmin,上清即可用于LC-MS分析。
[0070] 3) LC-MS 分析
[0071] 色谱分离义用 5cm 服S T3 柱（2. Imm 内径，1. 7 y m 粒径）（Waters, Milford, MA)， 同时使用CS预柱（Waters, Milford, MA)进行柱保护。进样量为5化.柱温设定为50°C . 流动相A为0. 1 %甲酸/水（v/v)，流动相B为纯己腊。液相洗脱梯度为；0-lmin，2% B ; l-2min线性升至20 % B,维持0. 5min ;在5min和6min，相继升至55 % B和60 % B, Smin处 升至100% B并维持Imin.单次样品运行时间为12min，其中包括预平衡的3min.流动相流 速为0. 3血/min.
[0072] MS在正离子模式下进行信号采集，质荷比扫描范围为200-1000道尔顿值a)。质谱 分辨率设为15K。离子源参数设置如下：銷气和辅助气流速分别为35和5个单位。！喷雾 电压和毛细管电压分别为4. 5kV和49V ;毛细管温度为35(TC ;离子传输管电压设为100V. [007引 4)数据处理
[0074] 原始数据导入软件Seive进行峰匹配，参数设置如下：m/z窗口设为IOppm ;保留 时间窗口为Imin ;最大的峰个数设为1000 ;最小峰强度阔为1000.其他参数为默认值。在 上述自动峰匹配中，同时对目标氨基酸进行祀向提取。祀向提取时峰的起止时间设为保留 时间减加〇.5min.氨基酸校正至相应样本的总峰面积后进行后续的统计分析。氨基酸代谢 轮廓比较采用主成分分析（PCA)。显著性分析采用Student' S t检验。
[00巧]通过主成分分析（图4)，发现PA干预组与对照组在氨基酸代谢轮廓上无明显区 分，POA和PA-POA干预组具有相似的氨基酸代谢轮廓，且远离对照组。送表明在稍高于生理 浓度的脂肪酸干预下，氨基酸池对POA干预更为敏感。与对照组比，POA与PA-POA联合干预 组的胞内Asp, Gln, Glu, Ser, Ala, Pro, Lys, Arg和Tb显著降低，仅Asn含量有所增高（表 3)。PA干预组胞内氨基酸与对照组无显著差异，可能是由于PA浓度稍高于10% FBS-DMEM 培养基中PA的浓度，不足W引起氨基酸代谢的扰动。
[0076] 表3踪搁油酸及联合干预组中与对照组具有显著差异的氨基酸
[0077]
[0078] 本发明公开的胞内代谢轮廓高通量分析方法具有简便快速，灵敏度高且重复性好 的特点，适合于96孔板内培养的细胞W及收获量少的细胞的代谢组高通量分析，如药物的 大规模筛选、评价W及干细胞研究等。
【主权项】
1. 细胞胞内氨基酸代谢轮廓分析方法，所述方法包括： (a) 取洗去培养基的细胞，利用冷甲醇水溶液对细胞进行代谢淬灭和低温静置提取，离 心或过滤，得细胞胞内代谢物提取液； (b) 采用丹磺酰氯作为衍生化试剂，对提取液中含氨基及酚羟基代谢物进行衍生，终止 衍生后，离心或过滤，收集衍生后的溶液； (c) 采用液相色谱-质谱联用的方法，在正离子模式下对衍生后溶液中的细胞胞内代 谢物进行检测。2. 根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤（c)采用高效液相色谱-质谱法进行 代谢轮廓分析； 以PBS清洗去除培养基后的细胞，得洗去培养基的细胞；PBS为预冷至0-4°C的PBS缓 冲盐溶液。3. 根据权利要求1所述方法，其特征在于：冷甲醇水溶液为预冷至0-4°C，体积含 量30-60%甲醇的水溶液，甲醇的水溶液中还含有同位素内标，同位素内标分别为浓度 0· 1-2. 5 μ g/mL 的 Ala_d4、Val_d8 和 Trp_d5 ; 采用冷甲醇水溶液对细胞淬灭后，进行低温静置代谢物提取，提取条件为：细胞淬灭后 的混合液静置于〇_4°C环境下30-60分钟。4. 根据权利要求1所述方法，其特征在于：用于细胞代谢物衍生的试剂包括：缓冲盐溶 液，衍生化试剂以及终止衍生化反应试剂；终止衍生后，离心或过滤，收集衍生后的溶液； 所述缓冲盐溶液指的是〇. 1-0. 5M碳酸钠/碳酸氢钠缓冲盐溶液； 采用0. 5-5mg/mL丹磺酰氯的乙腈溶液作为衍生化试剂； 缓冲盐溶液、衍生化试剂和提取液的体积比为1:1:1，衍生化反应温度为50-70°C，反 应时间为40-60min。5. 根据权利要求3所述方法，其特征在于： 以d6-丹磺酰氯作为参照衍生化试剂，进行辅助鉴定；用于细胞代谢物辅助衍生的试剂 包括：缓冲盐溶液，参照衍生化试剂以及终止衍生化反应试剂；终止衍生后，离心或过滤， 收集辅助衍生后的溶液； 所述缓冲盐溶液指的是〇. 1-0. 5M碳酸钠/碳酸氢钠缓冲盐溶液； 即采用0. 5-5mg/mL d6-丹磺酰氯的乙腈溶液作为辅助衍生化试剂，对提取液中含氨基 及酚羟基代谢物进行辅助衍生化； 缓冲盐溶液、附助衍生化试剂与提取液的体积比为1:1:1，衍生化反应温度为 50-70°C，反应时间为 40-60min。6. 根据权利要求1、3或4所述方法，其特征在于：所述终止衍生化反应试剂指的是 50-500 μ Μ 丁胺水溶液，于每150 μ L衍生体系或辅助衍生体系中终止衍生化反应试剂加入 量为 20-40 μ L。7. 根据权利要求4所述方法，其特征在于：辅助鉴定时，将辅助衍生后的溶液与衍生后 的溶液按等体积混合后再进行步骤（c)的检测分析过程。8. 根据权利要求1所述方法，其特征在于： 所测标本为细胞，步骤（a)所取细胞数量在103-104之间。9. 根据权利要求1所述方法，其特征在于：经衍生的含氨基及酚羟基代谢物，在正离子 模式下，形成质荷比为Μ(分子量）+234. 059, M+307. 148。10.根据权利要求1或8所述方法，其特征在于：所测标本为96孔板培养的细胞，96孔 板每一孔中培养的细胞为一个独立的分析样本。
【专利摘要】本发明公开了一种针对少量细胞(103-104个)的胞内代谢轮廓高通量分析方法，包括简便、高效的细胞淬灭及代谢物提取，代谢物衍生化，以及质谱检测等步骤。本发明公开的胞内代谢轮廓高通量分析方法具有简便快速，灵敏度高且重复性好的特点，适合于96孔板内培养的细胞以及收获量少的细胞的代谢组高通量分析，如药物的大规模筛选、评价以及干细胞研究等。
【IPC分类】G01N30/06, G01N30/02
【公开号】CN105527350
【申请号】CN201410581881
【发明人】许国旺, 周丽娜, 尹沛源, 高鹏, 路鑫
【申请人】中国科学院大连化学物理研究所
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2014年10月27日