细胞胞内氨基酸代谢轮廓分析方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分析化学领域，是一种针对少量细胞的胞内氨基酸代谢轮廓高通量分 析方法。
【背景技术】
[0002] 在系统生物学的理论框架下，借助代谢轮廓分析，将代谢表型及代谢通路的扰动 与其内在的病理生理机制联系起来的"多组学"研究已越来越多地被用于癌症研究，干细 胞和药效及药物毒理研究中。细胞代谢轮廓分析是实现上述研究目的的重要工具。在细胞 代谢轮廓分析中，细胞培养耗时多、预处理步骤繁杂等一直是限制分析通量提高的主要因 素。利用96孔组织培养板可W实现少量细胞（约IO 3-IO4个）的快速培养及高通量操作。 此外，在干细胞的研究中，可用于代谢轮廓分析的干细胞数目相对较少，常规的分析策略难 W获得丰富的代谢组数据。因此，实现少量细胞的代谢轮廓分析方法具有重要意义。
[0003] 虽然UPLC-MS分析灵敏度有了很大提高，但目前在检测胞内代谢组时常需要大量 细胞（〉l〇6cells)。由于代谢物种类繁多、结构多样，在少量细胞中代谢物整体含量较低，因 此在代谢物分析的覆盖率及灵敏度之间需要一个合适的平衡点。因此，我们采用了 "分而治 之"的策略，即针对不同类代谢物分别采用不同的预处理方法，提高其检测灵敏度，实现对 特定代谢通路的覆盖。氨基酸在细胞中具有非常重要的功能，既是蛋白质的基本组成单元， 也是重要的代谢调节分子。如谷氨醜胺是某些癌细胞的必需氨基酸，同时也用于维持H駿 酸循环。同时，氨基酸可W通过代谢回补通路来进出H駿酸循环，从而参与糖和脂类代谢， 因而氨基酸代谢轮廓可W部分反映中必碳代谢对内外源干预的响应。
[0004] 我们选择针对96孔板培养的细胞为研究对象，并首先W检测胞内氨基酸为目标 来研发高通量、高灵敏的96孔板细胞胞内代谢轮廓分析方法。提出的具体实验方案包括从 细胞预处理到LC-MS分析的全部流程。通过开发简便的细胞浑灭提取程序，可W在简化预 处理步骤的同时，提高提取的重复性。选用丹礙醜氯作为衍生化试剂，对氨基酸进行化学修 饰，可W增加极性较高的氨基酸类、其他含氨基或酪居基化合物在液相上的保留，减少离子 抑制，改善分析精度，提高其检测灵敏度。
[0005] 针对96孔板接种培养的细胞的胞内氨基酸类代谢轮廓分析，我们开发了简便的 细胞浑灭提取程序，同时结合丹醜化修饰来提高氨基酸的分析灵敏度，该方法可W实现对 96孔板接种培养的1〇3-10 4个细胞的胞内代谢物的高灵敏度、高通量检测。送一结果突破 了目前胞内代谢物检测中需要IO6-IO 7量级细胞的限制，可用于高通量的代谢物功能阐释， 还可用于新药快速筛选，及无法获得大量细胞的干细胞等相关研究中。我们将送一方法初 步应用于脂肪酸对化pG2细胞的干预实验中，验证了其实用性。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于建立一种针对96孔组织培养板上生长的细胞胞内代谢轮廓分 析方法，实现在少量细胞基础上的高灵敏、高通量的代谢轮廓分析，同时该方法也具有代谢 浑灭和代谢物提取简便的优点。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
[000引 （1) 96孔组织培养板中生长的细胞用冷PBS清洗后，利用冷甲醇/水对细胞进行代 谢浑灭和代谢物静置提取。样品浑灭、提取一步完成，预处理过程简单，无须冻融、超声等细 胞破碎过程；
[0009] (2)上清液或滤液用丹礙醜氯进行衍生，离必或过滤后上清用于上样分析。采用短 柱分析，并优化分离检测条件，可实现IO 3-IO4个细胞的胞内氨基酸及更多含氨基及酪居基 化合物的轮廓分析。
[0010] 具体步骤如下（图1):
[0011] (1)在96孔组织培养板中生长的细胞，先用150-250 iiL0-4°C PBS快速洗涂培养 于96孔板每一孔中的细胞H次。（2)然后于96孔板每一孔中迅速加入30-50 U L浑灭溶液 (0-4°C，含30-60%甲醇的水溶液，其中含浓度为0. 1-2. 5 U g/mL同位素内标Ala-d4, Va^d8 和T巧-d5)进行细胞代谢浑灭；继而在4°C下静置提取30-60min. (3)将96孔板每一孔中提 取液离必或用96孔过滤板过滤后，取40-70 U L上清或滤液用于衍生。
[0012] (4)向96孔板每一孔的上清或滤液中加入等体积的0. 1-0. 5M碳酸钢/碳酸氨钢 缓冲盐溶液，再加入与从96孔板每一孔中所得的上清或滤液等体积的0. 5-5mg/血丹礙醜 氯或d6-丹礙醜氯的己腊溶液，充分润旋混合。混合物在50-7(TC，130-160转每分（rpm) 条件下反应40-60min。再向上述混合物中加入20-40 y L 50-500 y M 了胺，同样条件下反应 20-30min来终止丹醜化反应。
[0013] (5)设置离必转速为13, 000巧m，离必lOmin，取上清进行96孔板每一孔中衍生液 LC-MS分析。
[0014] (6) LC/MS分析；选用柱长为5cm短柱作为分析柱（2. Imm内径，1. 7 U m粒径），同 时柱前连接预柱进行柱保护。预柱和分析柱的填充材料分别为高强度硅胶基质的辛基和 十八烷基键合颗粒。
[0015] 样品分析时，进样量为5 U L。柱温设定为40-6(TC。流动相A为0.1 %甲酸/水 (v/v)，流动相B为纯己腊。梯度洗脱程序为；〇-lmin, 2% B ;l-2min线性升至20% B,维持 0. 5min ;在5min和6min,相继升至55 % B和60 % B ;8min处升至100 % B并维持Imin.每 针运行时间为12min,包括预平衡的3min.流动相流速为0. 3mL/min.
[0016] 信号采集利用高分辨质谱在正离子模式下实现。质荷比扫描范围为200-1000化， 质谱分辨率设为15K。离子源参数设置如下：銷气和辅助气流速分别为35和5个单位。！喷 雾电压和毛细管电压分别为4. 5kV和49V ;毛细管温度为350°C;离子传输管电压设为100V.
[0017] 细胞提取物衍生溶液进样分析时，化合物信息提取及结构初判：含氨基或酪居基 的代谢物，在质谱正离子模式下能够形成两种特征离子：(M+234. 059) + ; (M+307. 148)+。在 将细胞提取物的辅助衍生溶液与衍生溶液等体积混合进样分析，可辅助代谢物的结构判 断。相邻保留时间内出现成对的双峰；代谢物的辅助衍生峰相对于衍生峰，质荷比理论上高 出6. 036Da，并且在液相上提前出峰，双峰的保留时间差值为6-15砂。某代谢物的谱图模式 如果符合上述特点，即可判断该代谢物含氨基或酪居基。
[0018] 发明效果；本发明开发的针对96孔板培养的细胞胞内氨基酸等含氨基和酪居 基化合物的代谢轮廓分析方法，代谢物丹醜化后在液相上保留增强，质谱检测时离子抑制 减少，引入丹醜化基团后正离子模式下代谢物离子化效率提高2-3个数量级，可实现对 1〇3-104个左右细胞胞内代谢物的高灵敏度分析。
[0019] 利用96孔组织培养板进行细胞培养及干预，试剂和材料消耗大幅降低，细胞培养 和操作通量高，经济又高效。其中针对96孔板上培养的细胞，将细胞从孔中转移出来进行 预处理或直接在板上进行原位提取都存在困难的问题，开发了针对少量细胞的代谢浑灭和 提取一步完成的预处理方法，减少了预处理步骤，操作简单、高效、避免了通过刮板或膜酶 消化等细胞收集方法对胞内代谢的影响，也无需复杂的反复冻融及超声等即可实现同等的 提取效率，具有较佳的提取重复性和回收率。
[0020] 对细胞胞内代谢提取物分别利用d6-丹礙醜氯及丹礙醜氯标记，等量混合后进行 液相色谱-质谱分析，可根据含氨基或酪居基代谢物特征的提取质谱谱图辅助未知代谢物 的鉴定。
【附图说明】
[0021] 图1高通量96孔板组织培养板培养细胞胞内代谢轮廓分析策略。
[0022] 图2辅助定性示例；如苏氨酸的由6d-丹礙醜氯和普通丹礙醜氯标记的双峰洗脱 顺序及质荷比差值。
[0023] 图3氨基酸提取效率比较；4t：下简单提取（无填充）与反复冻融H次补充冰水浴 中超声提取30分钟（斜线填充）。
[0024] 图4基于所有氨基酸的主成分分析情况，所有变量作单一方差标度化。对照（绿 色圆点）；踪搁酸（PA)处理（H角形）；踪搁油酸（POA)处理（菱形）；踪搁酸-踪搁油酸 (PA-POA)联合干预（黄色圆点）。
【具体实施方式】
[0025] 实施例1
[0026] 少量细胞胞内氨基酸代谢轮廓分析方法考察：
[0027] 1)在96孔板上接种培养胎pG2细胞
[0028] 在175cm2的细胞培养瓶中贴壁培养化pG2细胞；给予10% FBS的DMEM高糖培养 基，并在37°C，5% C02的恒定条件下令细胞汇合生长至60-70%。
[0029] 用膜蛋白酶消化细胞，细胞重悬于含10% FBS的DMEM培养基中。进行细胞计数， 制备密度为2 X IO4细胞/毫升的细胞悬液用于接种96孔板。
[0030] 在96孔板中，每孔接种100 U L上述化pG2细胞悬液（悬浮液用10 % FBS的DMEM 培养基配置而成），并保持在37C及5% C02的条件下培养4她。
[0031] 2)细胞浑灭和胞内代谢物提取
[0032] 胎pG2细胞生长4化后，先将96孔板每一孔中生长的细胞用200 U L冰冷PBS洗H 次，迅速加入50 U L 21 ;79 (v/v)，甲醇/水（4°C )对细胞进行代谢浑灭。迅速加入50 U L 80%的甲醇水溶液，其中含浓度为0. 5 U g/mL同位素内标Ala-d4, Va^d8和化p-d5,4°C下静 置提取30min.将提取混合物离必后，取50 U L上层清液用于衍生。
[0033] 3)标样溶液组成及