小麦光腥黑粉菌的激光共聚焦显微镜检方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物病害检测技术，特别是涉及小麦光腥黑粉菌的激光共聚焦显微镜检方法。
【背景技术】
[0002]由小麦光腥黑粉菌(Tilletiaf0etida(Wallr.)Lir0，TFL)引起的小麦光腥黑粉病是世界上最具破坏性的小麦病害之一，在我国北方麦区发生较多，是北京市补充农业植物检疫性有害生物。该病菌属于担子菌纲、半担子菌亚纲、黑粉菌目、腥黑粉菌科、腥黑粉菌属，可被土壤和种子传播。被该病菌侵染的小麦籽粒具有强烈鱼腥臭味，此病菌孢子含量超过0.6%即可引起严重中毒现象，人畜食后重者可引起恶心、呕吐甚至昏迷等中毒症状(Goats，1999;Hoffman，1982)，严重影响小麦品质及商业价值。我国曾严格规定小麦腥黑穗病粒超过6粒/公斤，将对整批污染的小麦不予收购(张金良等，2000)。该病害在春小麦和冬小麦上均有发生并遍布世界小麦种植区，腥黑穗病可侵染70%以上的麦穗，引起25%?50%的减产，严重的甚至绝产(Holton，1947)。腥黑穗病曾在甘肃省平均发病率达28%?38% (甘国福等，1995)。因此，只有对小麦光腥黑粉病进行早期预警，才能最大限度地减少该病带来的经济损失。
[0003]目前，采用对于疑似被小麦光腥黑粉菌侵染小麦的扫描电镜观察是普遍的方法，例如马青等人发表的《小麦光腥黑穗菌萌发的超微结构研究》1999西北农业大学学报中记载的方法及观察到的图片，不能一目了然地看到菌丝，由于没有经过染色，小麦光腥黑粉菌的菌丝和小麦组织没有很明显的分别特征，无法判断研究过程中，接种的小麦光腥黑粉菌是否成功接种。如果能给准确判断并获得成功接种的种子，将其用于下一步研究最好，能给提高下一步研究的效率。
【发明内容】
[0004]根据上述领域的不足和需求，本发明提供一种小麦光腥黑粉菌的显微镜检测方法，高效简单，染色效果好，使菌丝和植物材料在显微镜下对比度强，可清晰地观察到植物材料中菌丝侵染的程度。
[0005]本发明要求保护的技术方案如下:
[0006]小麦光腥黑粉菌的激光共聚焦显微镜检方法，其特征在于，包括如下步骤:
[0007](I)样品染色:将待测样品用染色液I染色10-30分钟，然后用10yg/mL WGA-AF 488染色10-30分钟，最后用pH 7.4的10 X PBS冲洗3-5次；
[0008]所染色液I 为 5yg/mL Propidiumidodide与 0.02 %Tween 20 以体积比 1:1混合而成；
[0009](2)镜检:将染色后的样品置于激光共聚焦显微镜下观察，采用的参数如下:
[0010]Propidiumidodide激发绿光波长为56Inm，发射光波长为590?640nm;WGA-AF 488激发蓝光波长为488nm，发射光波长为500?520nm，
[0011]如果显微镜下出现绿色的菌丝，说明待测样品含有小麦光腥黑粉菌。
[0012]所述待测样品为取自小麦成熟期根部、茎杆部或叶片部的组织。
[0013]所述待测样品染色之前采用乙醇固定。
[0014]实验结果表明，采用本发明方法观察小麦光腥黑粉菌侵染的植物组织，具有染色清晰、对比度强的优点，能够清楚地判断小麦光腥黑粉菌的侵染程度。
[0015]本发明的方法简单高效，易于操作。在研究小麦与寄生致病菌互作的过程中，能够简明地获知小麦光腥黑粉菌是否成功接种。从而准确判断并获得用于下一步研究的种苗，能够提高研究工作的效率。
【附图说明】
[0016]图1.采用本发明方法观察小麦光腥黑粉菌侵染的小麦相关组织，
[0017]其中，A，B，C(Merge)，D(明场)显示的是小麦成熟期根部被TFL菌丝侵染；E，F，G(Merge)，H(明场)显示的是小麦成熟期茎杆部被TFL菌丝侵染;I，J，K(Merge)，L(明场)显示的是小麦成熟期叶片部被TFL菌丝侵染。
【具体实施方式】
[0018]下面通过具体实施例作进一步的详细说明，需要理解的是，以下实施例仅作为解释和说明，而不以任何方式限制本发明的范围。
[0019]小麦光腥黑粉菌:采集自河南田间
[0020]小麦:冬选3号中国农业科学院植物保护研究所
[0021]下述实施例中未特别说明的生物化学试剂均为本领域常规试剂，可以通过商购获得或采用本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可。
[0022]实施例1.采用本发明方法观察小麦光腥黑粉菌侵染的小麦组织
[0023]取材:剪取小麦光腥黑粉菌侵染的小麦成熟期根部、茎杆部和叶片部，叶片剪段成5_左右的方块，去掉四周边缘使其充分浸泡在无水乙醇固定液中，子房和花药直接充分浸泡在无水乙醇固定液中
[0024]染色:将样品置于离心管中，加入0.5mL 5yg/mL Propidiumidodide，0.5mL
0.02%Tween 20染色20min，去掉染料，然后加入0.5mL 10yg/mL WGA-AF 488染色20min，去掉染料，用ImL pH 7.4的10 XPBS冲洗3至5次，然后用锡箔纸包裹离心管隔绝光亮后，置于4度冰箱中备用。
[0025]镜检:将上述染色后的样品置于载玻片上，加盖玻片倒置，将其置于激光共聚焦显微镜(SP8，LEICA，Germany)下观察。WGA-AF 488激发蓝光波长为488nm，发射光波长为500?520]1111;?1'0卩丨(1;[11111丨(10(1丨(16激发绿光波长为56111111，发射光波长为590?640111]1。
[0026]结果如图1所示4，8，(:(1^找6)，0(明场)显示的是被了?1^菌丝侵染的小麦成熟期根部;E，F，G(Merge)，H(明场)显示的是被TFL菌丝侵染的小麦成熟期茎杆部；I，J，K(Merge)，L(明场)显示的是被TFL菌丝侵染的小麦成熟期叶片部。
[0027]从图中可以观察到绿色的小麦光腥黑粉菌菌丝和红色的小麦组织，由此表明，采用本发明方法观察小麦光腥黑粉菌侵染的植物组织，具有染色清晰、对比度强的优点，能够清楚地判断小麦光腥黑粉菌的侵染程度。
【主权项】
1.小麦光腥黑粉菌的激光共聚焦显微镜检方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)样品染色:将待测样品用染色液I染色10-30分钟，然后用1yg/mLWGA-AF 488染色10-30分钟，最后用pH 7.4的10 X PBS冲洗3-5次； 所染色液I为5yg/mL Propidiumidodide与0.02%Tween 20以体积比1:1混合而成； (2)镜检:将染色后的样品置于激光共聚焦显微镜下观察，采用的参数如下: Propidiumidodide激发绿光波长为561nm，发射光波长为590?640nm;WGA_AF 488激发蓝光波长为488nm，发射光波长为500?520nm， 如果显微镜下出现绿色的菌丝，说明待测样品含有小麦光腥黑粉菌。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样品为取自小麦成熟期根部、茎杆部或叶片部的组织。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，样品染色之前采用乙醇固定。
【专利摘要】本发明属于植物病害研究技术，特别是涉及小麦光腥黑粉菌的激光共聚焦显微镜检方法。小麦光腥黑粉菌的激光共聚焦显微镜检方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)样品染色：将待测样品先后用Propidium？idodide和WGA-AF？488染色，然后用PBS冲洗；(2)镜检：将染色后的样品置于激光共聚焦显微镜下观察；如果显微镜下出现绿色的菌丝，说明待测样品含有小麦光腥黑粉菌。本发明的方法能够简明地判断用于研究的小麦是否成功接种小麦光腥黑粉菌。
【IPC分类】G01N1/30, G01N21/63
【公开号】CN105548091
【申请号】CN201510909600
【发明人】高利, 沈慧敏, 蔚慧欣, 李超, 陈万权, 刘太国, 刘博
【申请人】中国农业科学院植物保护研究所
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2015年12月10日