一种等温滴定量热法测定酶促反应动力学参数的方法
【专利说明】一种等温滴定量热法测定酶促反应动力学参数的方法 【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种酶促反应动力学参数检测技术，特别涉及一种等温滴定量热法测 定酶促反应动力学参数的方法。 【【背景技术】】
[0002] 酶促反应动力学参数在研究酶促反应中起着非常重要的作用。Km是酶的特征常 数，只与酶的性质有关而与酶的浓度无关。且K m可以反应酶同底物的亲和力，Km越小，酶同底 物的亲和力越大。因此，在实际应用中，通过测定K m，可以鉴别不同来源或相同来源但在不 同发育阶段，不同生理状态下催化相同反应的酶是否属于同一种酶;也是通过1的不同，找 出酶的最适底物和底物的最适反应浓度;还可以判断反应方向或趋势、不同抑制剂对酶的 抑制类型等等。
[0003] 根据米氏方程，测定米氏常数心和最大酶促反应速率vmax，需要测定不同浓度的酶 催化反应速率，反应速率为底物浓度不足以产生最大速率时的反应初速率。在测定中，需要 定义反应多久测出的速率才是初速率，反应时间过短，终止反应时产生的误差越大;反应时 间过长，终止反应后所得偏小；且在终止反应速率操作中，人为误差难以避免，因此造成米 氏常数的测定存在较大偏差。在酶促反应之后，还需分析手段对产物进行定量测定，最后才 能确定反应速率的大小。该类方法较为繁琐且有一定的局限性，比如在蛋白浓度较高时光 谱测定往往非常不准确，某些酶转化率非常低产物较难用直接的方法测定其含量。
[0004] 等温滴定量热法（ITC)是用于量化研究各种生物分子相互作用的一种技术，它可 实时直接测量生物分子结合过程中释放或吸收的热量。通过测量结合过程中的热流变化， 就能够准确地确定酶促反应的米氏常数Km和最大酶促反应速率 Vmax。等温滴定量热法(ITC ) 具有快速、微量、灵敏、操作简单的优点，且需药品更少，准确，做到实时监测，可克服传统方 法的缺陷，解决酶促反应动力学参数测定的繁琐和准确性的难题。 【
【发明内容】
】
[0005] 本发明提供一种等温滴定量热法测定酶促反应动力学参数的方法，以解决酶促反 应动力学参数测定的繁琐和准确性等问题。本发明的方法具有快速、微量、灵敏、操作简单 的特点，可有效降低酶促动力学参数测定中对酶和底物的消耗，简化测定酶促反应过程，提 高结果的准确性。
[0006] 为解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案：
[0007] -种等温滴定量热法测定酶促反应动力学参数的方法，是通过将底物滴加到含酶 的溶液中，检测出每次滴加后底物与酶反应的热功率，设定滴加底物的间隔时间，计算出不 同底物浓度时热功率的变化，测定得到酶促反应的米氏常数K m和最大酶促反应速率vmax。
[0008] 进一步地，所述的等温滴定量热法测定酶促反应动力学参数的方法，包括以下步 骤：
[0009] S1:配制0.1mol/L的缓冲液；
[0010] S2:用步骤S1配制好的缓冲液配制0.5ymol/L的酶溶液和10-15mmol/L底物溶液；
[0011] S 3 :将步骤S 2配制好的酶溶液、底物溶液分别注入量热池和注射器中，在转速 300r/min下搅拌酶溶液，待量热仪达到温度为298.15-313.15K并基线稳定平衡后自动开始 滴加底物溶液至酶溶液中，计算出不同底物浓度时热功率的变化，测定得到各个温度的米 氏常数K m和最大酶促反应速率vmax。
[0012] 更进一步地，步骤S1中所述缓冲液为硼酸溶液。
[0013] 更进一步地，步骤S1中所述缓冲液的pH值为8.3。
[0014]更进一步地，步骤S1中所述缓冲液含0.3mol/L的氯化钠溶液。
[0015] 更进一步地，步骤S1中所述缓冲液经孔径为0.22μπι过滤膜过滤所得。
[0016] 更进一步地，步骤S2中所述酶为血管紧张素转化酶，所述底物为马尿酸-组氨酸-亮氨酸。
[0017] 更进一步地，步骤S3中将酶溶液注入量热池中的体积为164yL。
[0018] 更进一步地，步骤S3中所述量热仪为等温滴定量热仪。
[0019] 更进一步地，步骤S3中所述底物溶液滴加至酶溶液中共20滴，每滴体积为lyL，每 滴时间间隔为60s，测定时间为1200s。
[0020] 本发明的方法，因为Km在一定程度上反应了酶与底物的亲和力，它是酶反应初速 率为Vmax的一半时底物的浓度，升高温度有利于增加有效分子碰撞的几率，所以在较高的温 度下底物更容易与ACE活性中心结合，同样底物浓度的增加也可以使分子有效碰撞的几率 增加，那么随着温度的升高，酶的活性中心被底物占据一半所需要的底物浓度会下降，即K m 随着温度的增大而减小。
[0021] 本发明的方法中各个温度的米氏常数1和最大酶促反应速率vmax采用公式（1)- (7)计算得到。
[0022] 量热实验直接测定的是热功率P，它反映了热效应Q随时间t的变化，如公式（1)所 示：
[0023]
(1)
[0024]热效应Q与底物的物质的量η及水解焓AHhydr成正比，如公式(2)所示：
[0025] Q = n · Δ Hhydr= [S]0 · V · Δ Hhydr (2)
[0026] 其中，[So]是初始的底物浓度，V是反应池的体积，则水解焓AHhydr可由公式⑶计 算，
[0027]
(3)
[0028] 由公式(1)-(3)得到酶促反应速率V，如公式(4)所示：
[0029]
⑷
[0030] 其中，[S]是某时刻底物的浓度，由热功率随时间的积分可得到底物浓度变化的函 数关系，如公式(5)所示：
[0031]
(5)
[0032] Mi chael is一Menten方程式（简称-家方程式）如（6)所不：
[0033]
(6)
[0034] 其中，Km为米氏常数，vmax为最大酶促反应速率，
[0035] 再通过公式(1)-(6)可以计算得到米氏常数1，如公式(7)所示：
[0036] (7)
[0037] 不反明共令以卜令Μ双米：
[0038] (1)本发明的方法具有快速、微量、灵敏、操作简单的特点，可有效降低酶促动力学 参数测定中对酶和底物的消耗，简化测定酶促反应过程，提高结果的准确性；
[0039] (2)本发明的方法不需要定量监测酶促反应产物的量，可直接根据反应热流变化 计算出动力学参数K4Pv max，有效降低了繁琐程度；
[0040] (3)本发明方法可用于检测各种酶与底物之间的催化反应，为酶促反应动力学参 数检测提供了一种新的方法。
【附图说明】 图1为不同温度下血管紧张素转化酶(ACE)催化马尿酸-组氨酸-亮氨酸(Hip-His-Leu HHL)水解反应的等温滴定量热曲线； 图2为不同温度下血管紧张素转化酶(ACE)催化马尿酸-组氨酸-亮氨酸(Hip-His-Leu HHL)反应动力学曲线。 【【具体实施方式】】
[0041] 为便于更好地理解本发明，通过以下实例加以说明，这些实例属于本发明的保护 范围，但不限制本发明的保护范围。
[0042] 在实施例中，等温滴定量热法测定酶促反应动力学参数的方法，包括以下步骤：
[0043] S1:配制O.lmol/L的缓冲液；
[0044] S2:用步骤S1配制好的缓冲液配制0.5ymol/L的酶溶液和10-15mmol/L底物溶液；
[0045] S 3 :将步骤S 2配制好的酶溶液、底物溶液分别注入量热池和注射器中，在转速 300r/min下搅拌酶溶液，待量热仪达到温度为298.15-313.15K并基线稳定平衡后自动开始 滴加底物溶液至酶溶液中，计算出不同底物浓度时热功率的变化，测定得到各个温度的米 氏常数Km和最大酶促反应速率v max。
[0046]其中：步骤S1中所述缓冲液为硼酸溶液。
[0047]步骤S1中所述缓冲液的pH值为8.3。
[0048]步骤S1中所述缓冲液含0.3mol/L的氯化钠溶液。
[0049] 步骤S1中所述缓冲液经孔径为0.22μπι过滤膜过滤所得。
[0050] 步骤S2中所述酶为血管紧张素转化酶，所述底物为马尿酸-组氨酸-亮氨酸。
[0051 ]步骤S3中将酶溶液注入量热池中的体积为164yL。
[0052]步骤S3中所述量热仪为等温滴定量热仪。
[0053] 步骤S3中所述底物溶液滴加至酶溶液中共20滴，每滴体积为lyL，每滴时间间隔为 60s，测定时间为1200s。
[0054] 以下通过更具体的实施例对本发明进行详细阐述。
[0055] 实施例1
[0056] -种等温滴定量热法测定酶促反应动力学参数的方法，包括以下步骤：
[0057] S1:配制pH值为8.3、浓度为0. lmol/L的硼酸缓冲液，所述缓冲液含0.3mol/L的氯 化钠溶液，将硼酸缓冲液经孔径为0.22μπι过滤膜过滤，以备用；
[0058]