S2:用步骤S1配制好的硼酸缓冲液配制0.5ymol/L的血管紧张素转化酶(ACE)溶液 和15mmol/L马尿酸-组氨酸-亮氨酸(Hip-His-Leu HHL)溶液；
[0059] S3:将步骤S2配制好的血管紧张素转化酶(ACE)溶液、马尿酸-组氨酸-亮氨酸 (Hip-His-Leu HHL)溶液分别注入等温滴定量热仪NANO ITC的量热池和注射器中，所述酶 (ACE)溶液注入量热池至满，体积为164yL，在转速300r/min下搅拌血管紧张素转化酶(ACE) 溶液，待等温滴定量热仪NANO ITC测定酶(ACE)溶液达到温度为298.15K并基线稳定平衡后 自动开始滴加马尿酸-组氨酸-亮氨酸(Hip-His-Leu HHL)溶液至血管紧张素转化酶(ACE) 溶液中，共20滴，每滴体积为lyL，每滴时间间隔为60s，测定时间为1200s，计算温度为 298.15K下的米氏常数K m和最大酶促反应速率vmax。
[0060] 实施例2
[0061] -种等温滴定量热法测定酶促反应动力学参数的方法，包括以下步骤：
[0062] S1:配制pH值为8.3、浓度为0. lmol/L的硼酸缓冲液，所述缓冲液含0.3mol/L的氯 化钠溶液，将硼酸缓冲液经孔径为0.22μπι过滤膜过滤，以备用；
[0063] S2:用步骤S1配制好的硼酸缓冲液配制0.5ymol/L的血管紧张素转化酶(ACE)溶液 和15mmol/L马尿酸-组氨酸-亮氨酸(Hip-His-Leu HHL)溶液；
[0064] S3:将步骤S2配制好的血管紧张素转化酶(ACE)溶液、马尿酸-组氨酸-亮氨酸 (Hip-His-Leu HHL)溶液分别注入等温滴定量热仪NANO ITC的量热池和注射器中，所述酶 (ACE)溶液注入量热池至满，体积为164yL，在转速300r/min下搅拌血管紧张素转化酶(ACE) 溶液，待等温滴定量热仪NANO ITC测定酶(ACE)溶液达到温度为303.15K并基线稳定平衡后 自动开始滴加马尿酸-组氨酸-亮氨酸(Hip-His-Leu HHL)溶液至血管紧张素转化酶(ACE) 溶液中，共20滴，每滴体积为lyL，每滴时间间隔为60s，测定时间为1200s，计算温度为 303.15K下的米氏常数K m和最大酶促反应速率vmax。
[0065] 实施例3
[0066] -种等温滴定量热法测定酶促反应动力学参数的方法，包括以下步骤：
[0067] S1:配制pH值为8.3、浓度为0. lmol/L的硼酸缓冲液，所述缓冲液含0.3mol/L的氯 化钠溶液，将硼酸缓冲液经孔径为0.22μπι过滤膜过滤，以备用；
[0068] S2:用步骤S1配制好的硼酸缓冲液配制0.5ymol/L的血管紧张素转化酶(ACE)溶液 和15mmol/L马尿酸-组氨酸-亮氨酸(Hip-His-Leu HHL)溶液；
[0069] S3:将步骤S2配制好的血管紧张素转化酶(ACE)溶液、马尿酸-组氨酸-亮氨酸 (Hip-His-Leu HHL)溶液分别注入等温滴定量热仪NANO ITC的量热池和注射器中，所述酶 (ACE)溶液注入量热池至满，体积为164yL，在转速300r/min下搅拌血管紧张素转化酶(ACE) 溶液，待等温滴定量热仪NANO ITC测定酶(ACE)溶液达到温度为308.15K并基线稳定平衡后 自动开始滴加马尿酸-组氨酸-亮氨酸(Hip-His-Leu HHL)溶液至血管紧张素转化酶(ACE) 溶液中，共20滴，每滴体积为lyL，每滴时间间隔为60s，测定时间为1200s，计算温度为 308.15K下的米氏常数K m和最大酶促反应速率vmax。
[0070] 实施例4
[0071] -种等温滴定量热法测定酶促反应动力学参数的方法，包括以下步骤：
[0072] S1:配制pH值为8.3、浓度为0. lmol/L的硼酸缓冲液，所述缓冲液含0.3mol/L的氯 化钠溶液，将硼酸缓冲液经孔径为0.22μπι过滤膜过滤，以备用；
[0073] S2:用步骤S1配制好的硼酸缓冲液配制0.5ymol/L的血管紧张素转化酶(ACE)溶液 和15mmol/L马尿酸-组氨酸-亮氨酸(Hip-His-Leu HHL)溶液；
[0074] S3:将步骤S2配制好的血管紧张素转化酶(ACE)溶液、马尿酸-组氨酸-亮氨酸 (Hip-His-Leu HHL)溶液分别注入等温滴定量热仪NANO ITC的量热池和注射器中，所述酶 (ACE)溶液注入量热池至满，体积为164yL，在转速300r/min下搅拌血管紧张素转化酶(ACE) 溶液，待等温滴定量热仪NANO ITC测定酶(ACE)溶液达到温度为313.15K并基线稳定平衡后 自动开始滴加马尿酸-组氨酸-亮氨酸(Hip-His-Leu HHL)溶液至血管紧张素转化酶(ACE) 溶液中，共20滴，每滴体积为lyL，每滴时间间隔为60s，测定时间为1200s，计算温度为 313.15K下的米氏常数K m和最大酶促反应速率vmax。
[0075] 对实施例1-4的数据进行处理，得到不同温度下血管紧张素转化酶(ACE)催化马尿 酸-组氨酸-亮氨酸(Hip-His-Leu HHL)水解反应的等温滴定量热曲线，如图1所示;不同温 度下血管紧张素转化酶(ACE)催化马尿酸-组氨酸-亮氨酸(Hip-His-Leu HHL)反应动力学 曲线，如图2所示;不同温度下米氏常数Km和最大酶促反应速率vmax，如表1所示。
[0076] 表1不同温度下米氏常数Km和最大酶促反应速率vmax
[0077]
[0078] 以上内容不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域 的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应 当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。
【主权项】
1. 一种等温滴定量热法测定酶促反应动力学参数的方法，其特征在于，将底物滴加到 含酶的溶液中，检测出每次滴加后底物与酶反应的热功率，通过设定滴加底物的间隔时间， 计算出不同底物浓度时热功率的变化，即可得到酶促反应的米氏常数K m和最大酶促反应速 -$-Vmax 〇2. 根据权利要求1所述的等温滴定量热法测定酶促反应动力学参数的方法，其特征在 于，包括以下步骤： S1:配制0. lmol/L的缓冲液； S2:用步骤S1配制好的缓冲液配制0.5ymol/L的酶溶液和10-15mmol/L底物溶液； S3:将步骤S2配制好的酶溶液、底物溶液分别注入量热池和注射器中，在转速300r/min 下搅拌酶溶液，待量热仪达到温度为298.15-313.15K并基线稳定平衡后自动开始滴加底物 溶液至酶溶液中，计算出不同底物浓度时热功率的变化，测定得到各个温度的米氏常数K m 和最大酶促反应速率Vmax。3. 根据权利要求2所述的等温滴定量热法测定酶促反应动力学参数的方法，其特征在 于，步骤S1中所述缓冲液为硼酸溶液。4. 根据权利要求2所述的等温滴定量热法测定酶促反应动力学参数的方法，其特征在 于，步骤S1中所述缓冲液的pH值为8.3。5. 根据权利要求2所述的等温滴定量热法测定酶促反应动力学参数的方法，其特征在 于，步骤S1中所述缓冲液含0.3mol/L的氯化钠溶液。6. 根据权利要求2所述的等温滴定量热法测定酶促反应动力学参数的方法，其特征在 于，步骤S1中所述缓冲液经孔径为0.22μπι过滤膜过滤所得。7. 根据权利要求2所述的等温滴定量热法测定酶促反应动力学参数的方法，其特征在 于，步骤S2中所述酶为血管紧张素转化酶，所述底物为马尿酸-组氨酸-亮氨酸。8. 根据权利要求2所述的等温滴定量热法测定酶促反应动力学参数的方法，其特征在 于，步骤S3中将酶溶液注入量热池中的体积为164yL。9. 根据权利要求2所述的等温滴定量热法测定酶促反应动力学参数的方法，其特征在 于，步骤S3中所述量热仪为等温滴定量热仪。10. 根据权利要求2所述的等温滴定量热法测定酶促反应动力学参数的方法，其特征在 于，步骤S3中所述底物溶液滴加至酶溶液中共20滴，每滴体积为lyL，每滴时间间隔为60s， 测定时间为1200s。
【专利摘要】本发明公开了一种等温滴定量热法测定酶促反应动力学参数的方法，属于酶促反应动力学参数检测技术领域，所述等温滴定量热法测定酶促反应动力学参数的方法是通过将底物滴加到含酶的溶液中，检测出每次滴加后底物与酶反应的热功率，设定滴加底物的间隔时间，计算出不同底物浓度时热功率的变化，测定得到酶促反应的米氏常数Km和最大酶促反应速率vmax。本发明的方法是对传统酶促反应动力学参数测定的改进，具有快速、微量、灵敏、操作简单的特点，可有效降低酶促动力学参数测定中对酶和底物的消耗，简化测定酶促反应过程，提高结果的准确性。
【IPC分类】G01N25/48, G01N31/16
【公开号】CN105675797
【申请号】CN201610075754
【发明人】廖丹葵, 彭尚, 周利琴, 孙丽霞, 孙建华, 廖彭莹, 刘彭如, 童张法
【申请人】广西大学
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年2月3日