一种母乳中左乙拉西坦的检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种母乳中左乙拉西坦的检测方法，包括以下步骤：(1)供试品制备：取供试母乳，加入供试母乳5倍体积的乙酸乙酯混匀，离心，取乙酸乙酯层，吹干，复溶，作为供试品；(2)检测：取步骤(1)的供试品用高效液相色谱进行检测，检测条件为：固定相：C18色谱柱；流动相：甲醇-无机盐溶液，二者的体积比为17:83，所述无机盐溶液的pH为4.5；检测波长：210nm。本发明方法可以准确检测母乳中左乙拉西坦，并且检测方法快速简便，专属性强，灵敏度高，稳定性好，可用于临床检测母乳中左乙拉西坦的浓度，为服用左乙拉西坦的哺乳期妇女喂母乳提供指导。
【专利说明】
-种母乳中左乙拉西坦的检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物药物分析领域，具体设及一种母乳中左乙拉西坦的检测方法。
【背景技术】
[0002] 左乙拉西坦（levetiracetam，LEV,商品名KePPra)是新一代抗癒痛药物，属化 咯烧酬衍生物。化咯烧酬类促智药属于五元杂环内献胺类促智药，可视为丫-氨基下酸 (GABA)的衍生物，对参与神经保护和记忆过程的受体具有特殊作用，是目前最引人注目的 一类促智药，具有广谱、起效迅速的抗癒痛活性，药物代谢动力学特性较理想、耐受性和安 全性好，特别适用于成人和儿童的难治性部分性发作的辅助治疗。左乙拉西坦的结构与作 用机制均与其他抗癒痛药物不同，它的药代动力学与给药剂量呈线性关系，生物利用度能 达到100%，不具备肝药酶诱导效应，大约91%的剂量能通过肾脏排泄；而且可W通过监控 血浆中LEV的浓度来优化治疗效果，特别对于有肾损伤的病人或者小孩具有良好的效果， 且不良反应小，LEV于2000年经FDA获准在美国上市，2007年3月10日在中国上市（商品 名开浦兰）。
[0003] 由于上述优点，该药物成了全世界妊娠期女性常用的抗癒痛药物。然而，因哺乳期 妇女服用左乙拉西坦W后，母乳中是否含有左乙拉西坦W及含有的左乙拉西坦浓度均不清 楚，导致很多服用左乙拉西坦的癒痛女性不敢给孩子喂母乳，最后只能直接选择奶粉喂养， 增加了癒痛患者家庭的经济负担，最重要的是奶粉不含母乳所含的所有免疫成分，而且奶 粉喂养也不能替代母乳喂养在培养亲子感情方面的重要作用。因此，有效检测母乳中的左 乙拉西坦具有重要意义。
[0004] 但是，目前尚没有关于检测母乳中左乙拉西坦方法的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供了一种母乳中左乙拉西坦的检测方法。
[0006] 本发明提供了一种母乳中左乙拉西坦的检测方法：它是采用高效液相色谱法进行 检测，包括W下步骤：（1)供试品制备：取供试母乳，加入供试母乳5倍体积的乙酸乙醋混 匀，离屯、，取乙酸乙醋层，吹干，复溶，作为供试品；（2)检测：取步骤（1)的供试品用高效液 相色谱进行检测，检测条件为：固定相：C18色谱柱；流动相：甲醇-无机盐溶液，二者的体 积比为17:83,所述无机盐溶液的抑为4. 5 ;检测波长：210皿。
[0007] 进一步优选地，所述检测方法是定量检测方法，步骤如下：a、供试品制备：取供试 母乳，加入1/9倍体积的对乙酷氨基酪标准品溶液，混匀，得内标供试母乳，再加入内标供 试母乳5倍体积的乙酸乙醋混匀，离屯、，取乙酸乙醋层，吹干，复溶，作为供试品；b、标准品 制备：取空白母乳，加入1/8倍体积的左乙拉西坦标准品溶液和1/8倍体积的对乙酷氨基酪 标准品溶液，混匀，得标样母乳，再加入标样母乳5倍体积的乙酸乙醋，混匀，离屯、，取乙酸 乙醋层，吹干，复溶，作为标准品；C、检测：取步骤a的供试品和步骤b的标准品，用高效液 相色谱进行检测，检测条件为：固定相：C18色谱柱；流动相：甲醇-无机盐溶液，二者的体 积比为17:83,所述无机盐的溶液的抑为4. 5 ;检测波长：210nm ;d、绘制标准曲线，计算供 试品中左乙拉西坦的含量。 阳OO引进一步优选地，步骤a或步骤b中，对乙酷氨基酪标准品溶液的浓度为10 y g/mL。
[0009] 母乳：是产后女性乳房产生的用作哺育婴儿的汁液。
[0010] 空白母乳：是指来自于未服用左乙拉西坦妇女的母乳。
[0011] 进一步优选地，步骤（1)、步骤a或步骤b中，离屯、的转速是4000r/min，离屯、的时 间为IOmin。
[0012] 进一步优选地，步骤（1)、步骤a或步骤b中，吹干是在50°C条件下用氮气吹干。
[0013] 进一步优选地，步骤（1)、步骤a或步骤b中，复溶是采用步骤（2)中的流动相复 溶。
[0014] 进一步优选地，步骤（2)或步骤C中，所述C18色谱柱的规格为150mmX4. 6mm，填 料粒径为5ym。
[001引进一步优选地，步骤似或步骤C中，所述流动相中，无机盐溶液是浓度为 0.0 lmol/L的憐酸二氨钟溶液。
[0016] 进一步优选地，步骤（2)或步骤C中，流动相的流速1. 0血/min。
[0017] 进一步优选地，步骤（2)或步骤C中，检测的柱溫为30°C。
[0018] 高效液相色谱是检测领域常用的检测方法，但是由于母乳本身的成分复杂，干扰 杂质多，会干扰左乙拉西坦的测定，而且左乙拉西坦在母乳中的代谢产物也会干扰左乙拉 西坦的测定，另外，由于母乳中左乙拉西坦的浓度低，不易富集，检测难度大。
[0019] 本发明通过特定的前处理方法与特定高效液相色谱检测条件的结合，达到了准确 检测母乳中左乙拉西坦的目的，并且，本发明方法快速简便，专属性强，灵敏度高，稳定性 好，可用于临床检测母乳中左乙拉西坦的浓度，为服用左乙拉西坦的哺乳期妇女喂母乳提 供指导。
[0020] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可W做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0021] W下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于W下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0022] 图1为本发明试验例1空白母乳的高效液相色谱图。
[0023] 图2为本发明试验例1标样母乳的高效液相色谱图。
[0024] 图3为本发明试验例1供试母乳的高效液相色谱图。
[0025] 图4为按本发明试验例2方法所得的标准曲线图。 阳0%] 图5为本发明试验例5拉莫=嗦的高效液相色谱图。
[0027] 图6为本发明试验例5奥卡西平的高效液相色谱图。
【具体实施方式】
[0028] 本发明【具体实施方式】中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获 得。具体如下：实验材料：左乙拉西坦标准品：12-YM-175-1, Toronto Research Qiemicals Inc ;甲醇：分析纯（20120921)，成都市科龙化工试剂厂；憐酸二氨钟：分析纯（20091010)， 成都市科龙化工试剂厂；乙酸乙醋：分析纯（20120414)，成都市科龙化工试剂厂。主要实验 仪器：高效液相色谱仪：LC-20AB，日本岛津公司；紫外扫描仪：UV-VIS282PC，Unico仪器有 限公司。供试母乳来自服用了左乙拉西坦妇女的母乳。
[0029] 实施例1本发明定量检测方法
[0030] (1)供试品的制备：取供试母乳180 y L，置于1. 5血离屯、管中，加入浓度为10 y g/ 血的对乙酷氨基酪标准液20 y以旋满混合20s，作为内标供试母乳。向上述内标供试母乳 中加入1血乙酸乙醋，旋满混合20s，4000;r/min离屯、lOmin，吸取上层乙酸乙醋层于1. 5血 离屯、管中，在50°C水浴下用氮气吹干，加入100 y L流动相后旋满混合20s，作为供试品。 阳〇3U 似标准品的制备：取空白母乳160化，置于1.5血离屯、管中，加入浓度为IOii g/ 血的对乙酷氨基酪标准液20 y L，再分别加入浓度为10,20,40,100,200和400 y g/mL左 乙拉西坦标准品溶液20 y L旋满混合20s，使左乙拉西坦浓度分别为1，2,4,10,20,40 y g/ mU作为标样母乳。向该标样母乳中加入ImL乙酸乙醋，旋满混合20s，4000;r/min离屯、 lOmin，吸取上层乙酸乙醋层于1.5血离屯、管中，在50°C水浴下用氮气吹干，加入IOOy L流 动相后旋满混合20s，作为标准品。 阳0巧 做分别取供试品和标准品进行检测，进样量为20化，色谱条件如下：色谱柱为 Diamonsil C18 巧 Jim 150mmX4.6mm)，流动相为甲醇-憐酸二氨钟化 01mol/LpH4.5) (17:83)，等度洗脱；柱溫为30°C ;流速为1血/min ;检测波长为210皿。
[0033] (4)制作标准曲线：X轴为左乙拉西坦和对乙酷氨基酪的峰面积比，Y轴为左乙拉 西坦和对乙酷氨基酪的浓度比；根据标准曲线，计算供试母乳中左乙拉西坦的含量。
[0034] 实施例2本发明定性检测方法 阳03引 （1)供试品的制备：取供试母乳200化，置于1. 5血离屯、管中，加入1血乙酸乙醋， 旋满混合20s，4000r/min离屯、lOmin，吸取上层乙酸乙醋层于1. 5血离屯、管中，在50°C水浴 下用氮气吹干，加入100 y L流动相后旋满混合20s，作为供试品。
[0036] (2)取供试品进行检测，进样量为20 iiL色谱条件如下：色谱柱为Diamonsil C18 巧 ym 150mmX4. 6mm)，流动相为甲醇-憐酸二氨钟 〇). Olmol/L，pH4. 5)(17:8：3)，等度 洗脱；柱溫为30°C ;流速为1血/min ;检测波长为210皿。
[0037] 为进一步说明本发明方法的有益效果，本发明提供W下试验例。
[003引试验例1系统适用性和专属性实验
[0039] 取空白母乳、加入了内标物对乙酷氨基酪和左乙拉西坦（浓度10 y g/mL)标准品 的标样母乳和加入内标物对乙酷氨基酪的内标供试母乳，按实施例1的方法测定，所得色 谱图分别如图1、图2、图3所示。可W看出，内标物对乙酷氨基酪和左乙拉西坦的出峰时间 分别为8. 612min、ll. 844min，对乙酷氨基酪和左乙拉西坦完全分离，且无内源性杂质干扰， 证明本发明的方法分离度好，无内源性杂质干扰，且出峰时间短，检测效率高。 W40] 试验例2标准曲线的绘制
[0041] 对实施例1标样母乳的高效液相色谱测定结果如表1所示，W左乙拉西坦和对乙 酷氨基酪的浓度比Y对左乙拉西坦和对乙酷氨基酪的峰面积比X线性回归，得左乙拉西坦 的标准曲线方程Y = 6. 856832X+0. 4314762巧=0. 9995, n = 2)，标准曲线图见图4。证 明按照本发明的方法，母乳中左乙拉西坦的检出限可达1.0 ^邑/111以灵敏度高，且在1.0 ~ 40. 0 y g/mL浓度范围内线性关系良好，准确度好。表中LEV表示左乙拉西坦，Auv和A ISTD分 别表示左乙拉西坦和对乙酷氨基酪的峰面积，AuvAistd表示同一色谱图中左乙拉西坦和对 乙酷氨基酪的峰面积比。
[0042] 表 1
[0043]
[0044] 试验例3精密度实验
[0045] 按照实施例1中步骤（2)的方法制备左乙拉西坦浓度分别为1. 0,10. 0,40. 0 y g/ mL的标样母乳各5份，分别作为低、中、高立种浓度的标样母乳。按照实施例1中的方法，在 同一天内和同一周内分别对上述5份低、中、高=种浓度的标样母乳进行测定并计算其日 内精密度值和日间精密度值。上述低、中、高=种浓度的标样母乳日内RSD (n = 5)分别为 3. 51 %、3. 13%、5. 15%;日间 RSD (n = 5)分别为 4. 40%、6. 99%、6. 33%，说明本发明的方 法精密度好。
[0046] 试验例4回收率实验
[0047] 按照实施例1中步骤（2)的方法制备左乙拉西坦浓度分别为1. 0,10. 0,40. 0 y g/ mL的标样母乳各5份，分别作为低、中、高S种浓度的标样母乳。按照实施例1中的方法，测 定浓度与实际配置浓度之比计算回收率。上述低、中、高=种浓度的标样母乳平均回收率分 别为 103. 20%、80. 61%、92. 58%，其 RSD(n = 5)分别为 5. 36%、2. 73%、3. 74%，平均回收 率均大于80%，说明本发明的方法准确度好。
[0048] 试验例5抗干扰性实验
[0049] 左乙拉西坦临床常与抗癒痛药物拉莫=嗦、奥卡西平联合使用，因此有必要进行 左乙拉西坦的抗干扰性实验。分别取空白母乳180 iiL，置于I. 5血离屯、管中，分别加入 10 y g/mL的拉莫S嗦20 y L和10 y g/mL的奥卡西平20 y L作为供试母乳样品。向上述母 乳中加入1血乙酸乙醋，旋满混合20s，4000;r/min离屯、lOmin，吸取上层乙酸乙醋层850 Ji L 于1. 5mL离屯、管中，在50°C水浴下用氮气吹干，加入100 y L流动相后旋满混合20s，按照实 施例1中步骤（3)的方法测定。可W看出，拉莫=嗦和奥卡西平在本发明方法的检测条件 下无吸收，说明本发明方法在临床上的抗干扰性强。
[0050] 综上所述，本发明检测方法快速简便，专属性强，灵敏度高，精密度好，准确性高， 稳定性好，抗干扰性强，适用于临床应用。
【主权项】
1. 一种母乳中左乙拉西坦的检测方法，其特征在于：它是采用高效液相色谱法进行检 测，包括以下步骤： (1) 供试品制备：取供试母乳，加入供试母乳5倍体积的乙酸乙酯混匀，离心，取乙酸乙 酯层，吹干，复溶，作为供试品； (2) 检测：取步骤（1)的供试品用高效液相色谱进行检测，检测条件为：固定相：C18色 谱柱；流动相：甲醇-无机盐溶液，二者的体积比为17:83,所述无机盐溶液的pH为4. 5 ;检 测波长：210nm〇2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述检测方法是定量检测方法，步骤如 下： a、 供试品制备：取供试母乳，加入1/9倍体积的对乙酰氨基酚标准品溶液，混匀，得内 标供试母乳，再加入内标供试母乳5倍体积的乙酸乙酯混匀，离心，取乙酸乙酯层，吹干，复 溶，作为供试品； b、 标准品制备：取空白母乳，加入1/8倍体积的左乙拉西坦标准品溶液和1/8倍体积的 对乙酰氨基酚标准品溶液，混匀，得标样母乳，再加入标样母乳5倍体积的乙酸乙酯，混匀， 离心，取乙酸乙酯层，吹干，复溶，作为标准品； c、 检测：取步骤a的供试品和步骤b的标准品，用高效液相色谱进行检测，检测条件为： 固定相：C18色谱柱；流动相：甲醇-无机盐溶液，二者的体积比为17:83,所述无机盐的溶 液的pH为4. 5 ;检测波长：210nm ; d、 绘制标准曲线，计算供试母乳中左乙拉西坦的含量。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤a或步骤b中，对乙酰氨基酚标准品 溶液的浓度为10 μ g/mL。4. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（1)、步骤a或步骤b中，离心的 转速是4000r/min，离心的时间为lOmin。5. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（1)、步骤a或步骤b中，吹干是 在50°C条件下用氮气吹干。6. 根据1或2所述的方法，其特征在于：步骤（1)、步骤a或步骤b中，复溶是采用步骤 (2)中的流动相复溶。7. 根据1或2所述的方法，其特征在于：步骤（2)或步骤c中，所述C18色谱柱的规格 为150mmX4. 6mm，填料粒径为5 μ m〇8. 根据1或2所述的方法，其特征在于：步骤（2)或步骤c中，所述流动相中，无机盐 溶液是浓度为〇. 〇lmol/L的磷酸二氢钾溶液。9. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（2)或步骤c中，流动相的流速 1. 0mL/min〇10. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（2)或步骤C中，检测的柱温 为 30°C。
【文档编号】G01N30/02GK105987961SQ201510058331
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月4日
【发明人】陈蕾, 周东, 谢贞建
【申请人】四川大学华西医院