一种光学纯2-羟基丁酸的生物制备新方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物催化制备药物中间体和绿色化学领域，设及一种由苏氨酸一锅法 制备光学纯2-径基下酸的方法。主要设及一种(10-2-?基下酸与（5)-2-?基下酸的生物制 备新方法。
【背景技术】
[0002] 手性2-径基下酸可广泛应用于药物合成、生物可降解材料及精细化学品的合成。 如(10-2-?基下酸可用于抗癒痛药物左乙拉西坦及布瓦西坦的合成，（5)-2-?基下酸则可 用于PPARa括抗剂(R)-K-13675与PPAR 丫括抗剂MK-0533的合成。此外，光学纯的2-径基下 酸在生物可降解材料领域也有巨大的应用前景。
[0003] 文献报道光学纯2-径基下酸的生产主要有2-下酬酸的酶催化还原法、2-径基下酸 的酶催化拆分法，如马翠卿等(CN101974603)报道了利用含NAD(烟酷胺腺嚷岭双核巧酸） 非依赖性1-径酸脱氨酶的微生物完整细胞或粗酶液拆分2-径基下酸生成(10-2-?基下酸 及2-下酬酸的方法。由于2-下酬酸及2-径基下酸生产成本较高，致使光学醇2-径基下酸生 产成本居高不下。文献调研发现苏氨酸脱水酶可W催化苏氨酸脱水生成2-下酬酸，但是，由 于2-下酬酸对该酶具有较大的抑制作用，致使累积的产物浓度不是很高。
[0004] 我们发现目前生物催化合成(10-2-?基下酸或(5)-2-?基下酸的工艺中，尚没有 利用生物催化剂由苏氨酸一锅法合成(10-2-?基下酸或(5)-2-?基下酸的方法。本方法利 用苏氨酸脱水酶、乳酸脱氨酶与甲酸脱氨酶进行串联反应或在基因工程菌中共表达苏氨酸 脱水酶、乳酸脱氨酶与甲酸脱氨酶，由苏氨酸一锅法制备(10-2-?基下酸或（5)-2-?基下 酸。该过程具有反应条件溫和、反应速度快、无污染和工艺路线简单等显著特点。
【发明内容】
[0005] 针对已报道制备方法中（10-2-?基下酸或(5)-2-?基下酸产物浓度低、光学纯度 不高、生产成本高等问题，本发明提出利用苏氨酸脱水酶、乳酸脱氨酶与甲酸脱氨酶催化苏 氨酸一锅法生产(R)-2-超基下酸或(S)-2-超基下酸。（如化学方程式1)。
[0006] 化学方程式1合成路线。
[0007] 本发明的具体步骤如下： 1.单表达载体的构建 本发明中所述的产苏氨酸脱水酶的基因工程菌，具体的构建方法是：W大肠杆菌K12基 因组DNA为模板，根据预先设计好的引物i 1 vA-F(CGCGGATCCGATGGCTGACTCGCAAC)和i 1 vA-R (CCCAAGCTTTCACTAACCCGCCAAAAAG)的PCR扩增条件和扩增体系进行PCR，得到i I vA基因， BamHI和HindIII双酶切后与BamHI和HindIII双酶切后的pRSFduet载体连接，转化化21 (DE3)感受态，挑取单克隆摇菌，提质粒进行双酶切验证，酶切片段大小正确的质粒进行测 序进一步验证。
[0008] 本发明中所述的产乳酸脱氨酶的基因工程菌，具体的构建方法是:将来源于表皮 葡萄球菌（51:日地5^1〇(3〇(3州8 691(161'1111(113)41'〔〔 12228的0型乳酸脱氨酶基因（0-〇)的和来 源于家兔(化yctolagus cuniculus )的L型乳酸脱氨酶基因化-LDH)由上海旭冠公司合成， 分别连接在pRSFduet和祀T32a载体上。然后将表达载体分别转入化21 (DE3)感受态，挑取 单克隆摇菌，并对基因工程菌进行发酵培养，实现了 D型乳酸脱氨酶与L型乳酸脱氨酶的高 效异源表达。
[0009] 2.双酶共表达载体的构建 分别将pRSFduet-D-LDH和祀T32aA-LDH用Nde巧日趾〇1酶切，胶回收D-LD^PkL畑基 因片段，分别连接到pRSFduet-i 1 vA载体的第二个表达框，转化化21 (DE3)感受态，挑取单 克隆摇菌，提质粒进行双酶切验证，酶切片段大小正确的质粒进行测序进一步验证，得到 pRSFduet-ilvA- D -LDH and pRSFduet-ilvA- L -LDH双酶共表达载体。
[0010] 3.=酶共表达载体的构建 从本实验室保存质粒pET21d-FDH上扩增得到来源于博伊下假丝酵母（Candida boidinii)的甲酸脱氨酶的整个表达框(包含RBS序列和启动子），通过互补序列用一步克隆 试剂盒将片段连接在pRSFduet-i IvAA-LDH and pRSFduet-i IvA-D-LDH双表达载体上，转 化化21 (DE3)感受态，挑取单克隆摇菌，提质粒进行双酶切验证，酶切片段大小正确的质粒 进行测序进一步验证，得到pRSFduet-i 1 vAA-LDH-抑H 和 pRSFduet-i 1 vA-D-LDH-抑HS酶 共表达载体。然后将分别表达载体转入化21 (DE3)感受态，挑取单克隆摇菌，并对基因工程 菌进行发酵培养，实现高效异源表达。
[0011] 4.酶的表达与菌体收集 将含有质粒的大肠杆菌化21 (DE3)在37°C摇床过夜培养种子液,1%接种LB液体培养基 中进行培养，37°C培养至0D600约0.8后，向其中加入终浓度0.1 mM的异丙基-P-D-硫代化喃 半乳糖巧（IPTG)进行诱导表达，诱导溫度为25°C，诱导时间为20小时。诱导表达结束后，于 6000巧m离屯、20分钟收集菌体。
[0012] 本发明中所述的苏氨酸脱水酶、乳酸脱氨酶与甲酸脱氨酶重组菌及=酶共表达重 组菌所用到的载体系列包括:pET系列质粒、pTXBl系列、pGEX系列、pETduet系列、pTYB系列。
[0013] 本发明中所述的苏氨酸脱水酶、乳酸脱氨酶与甲酸脱氨酶重组菌及=酶共表达重 组菌，其特征在于所述的能高效表达外源基因的宿主菌为下列之一 :BL21系列、Rosetta系 列、Origami系列、Tuner系列。
[0014] 在本发明中，由构建的苏氨酸脱水酶质粒、D-乳酸脱氨酶质粒、L-乳酸脱氨酶质 粒、甲酸脱氨酶质粒W及=酶共表达质粒转化宿主得到的转化体可W基于已知信息生长并 产生本发明所述的苏氨酸脱水酶、D-乳酸脱氨酶、1^-乳酸脱氨酶和甲酸脱氨酶。任何一种人 工的或天然的含有合适碳源、氮源、无机和其他营养物质的介质，只要能满足宿主菌体的生 长并且能够表达出目的蛋白均可使用。培养方法和培养条件没有明确的限制，可W根据培 养方法和类型等的不同而进行适当的选择，只要能满足宿主生长并能产生相应活性的苏氨 酸脱水酶、D-乳酸脱氨酶、乳酸脱氨酶和甲酸脱氨酶即可。
[0015] 本发明还设及利用苏氨酸脱水酶、甲酸脱氨酶和D-乳酸脱氨酶或k乳酸脱氨酶转 化苏氨酸制备(10-2-?基下酸或(5)-2-?基下酸的方法，所述方法为： 1)将所述产苏氨酸脱水酶、甲酸脱氨酶、D-乳酸脱氨酶或k乳酸脱氨酶的基因工程菌 经种子培养基培养，按一定比例接种到发酵培养基，培养一定时间后，加入诱导剂IPTG或乳 糖或二者混合物诱导培养一定时间，离屯、收集菌体，然后将苏氨酸脱水酶、甲酸脱氨酶和D-乳酸脱氨酶或レ乳酸脱氨酶加入到pH值为7.0~8.5的缓冲液(含35.7~89.3 g/L苏氨酸、 62.4~156g/L甲酸钢、0~0.1mM憐酸化唉醒(PLP)、0.5g/LNAD+)，利用抑在线调控系统， 流加2 M HC1，控制反应体系的抑维持在7.0~8.5,在25~30 °C反应完全后经离屯、、酸化、 萃取、脱溶后得到(10-2-?基下酸或(5)-2-?基下酸，收率大于90%。
[0016] 2)将所述产苏氨酸脱水酶、甲酸脱氨酶、D-乳酸脱氨酶或k乳酸脱氨酶的共表达 基因工程菌经种子培养基培养，按一定比例接种到发酵培养基，培养一定时间后，加入诱导 剂IPTG或乳糖或二者混合物诱导培养一定时间，离屯、收集菌体，加入pH值为7.0~8.5的缓 冲液(含35.7~89.3 g/L苏氨酸、62.4~156 g/L甲酸钢、0~0.1 mM PLP、0.5 g/L NAD+)，利 用抑在线调控系统，流加2 M肥1，控制反应体系的pH维持在7.0~8.5,在25~30 °C反应完 全后经离屯、、酸化、萃取、脱溶后得到(10-2-?基下酸或(5)-2-?基下酸，收率大于90%。
[0017] 反应中适用的介质可W是水或含有不同缓冲液的水介质，其所用的缓冲液可W是 水中加入一种或几种憐酸盐或化is硫酸盐。
[0018] 本发明所述的抑值优选苏氨酸脱水酶、甲酸脱氨酶、D-乳酸脱氨酶或心乳酸脱氨 酶可W表达其活性的pH范围内，优选抑值为7.0~8.5。反应溫度优选苏氨酸脱水酶、甲酸脱 氨酶、D-乳酸脱氨酶或k乳酸脱氨酶可W表达其活性的溫度范围内，优选20~40°C。
[0019] 本发明所述的催化剂是可W是全细胞、破菌液、粗酶及纯酶。
【具体实施方式】
[0020] W下通过具体的实施例来进一步说明，其目的在于更好的理解
【发明内容】
，但是运 些实施例不构成对本发明的限制。
[0021] 实施实例1基因工程菌的培养和静息细胞的制备 挑取平板上单菌落接种至5 ml含相应抗生素的发酵培养基中，培养15 h左右作为种子 液，按照1%的接种量接种至含600 ml的发酵培养基中，在37°C，200 rpm的摇床上培养至 0〇6〇日=0