.6~0.8左右，加入终浓度为0.11111的1?16于25°(：进行诱导10 11^上，从8000巧111离 屯、培养液收集菌体。
[0022] 实施实例2苏氨酸脱水酶、甲酸脱氨酶、D-乳酸脱氨酶重组菌静息细胞一锅法合 成(10-2-?基下酸 在250血S口瓶中，依次加入89血水、8.93 g苏氨酸、3.58 g憐酸氨二钢、15.6 g甲酸 钢、1 ml 10 ml PLP与50 mg NAD%调节pH至7.0,然后加入0.6 g苏氨酸脱水酶工程菌的 静息细胞(湿重，240U)、10 mL甲酸脱氨酶酶液（IOU)与1.6 g D-乳酸脱氨酶工程菌的静息 细胞(湿重，149抓），利用抑在线调控系统，向反应体系流加2M HCl溶液，控制反应体系的抑 维持在抑7.0左右，反应溫度控制在25~30°C。反应24小时后，高效液相色谱检测显示反应 完全（Agilent 1200 series HPLC'Acclaim 120 C18 column (4.6X250 mm, 5.0 皿））， 6M盐酸调节抑至I~2,离屯、收集上层清液，分别用200 ml乙酸乙醋萃取3次，合并有机相，无 水硫酸钢干燥，过滤，旋蒸回收溶剂得浅黄色油状产品(10-2-?基下酸7.41 g，收率95%，ee 值大于99%。lHNMR(400 MHz，CDCl3):S=4.26(dd，J=6.8，4.6Hz，lH)，1.83-1.99 (m, 1 H), 1.76 (dquin, J=14.3, 7.2, 7.2, 7.2, 7.2 Hz, I H), 1.01 (t, J= 7.4 Hz, 3 H). "C 匪R (100 MHz, CDCb): 5 = 179.55，71.32，27.26，8.95. MS 化SI): m/z: calcd for C祖7〇3_: 103.0395 [M-H]-，found: 103.0401. 实施实例3苏氨酸脱水酶、甲酸脱氨酶a-乳酸脱氨酶重组菌静息细胞催化苏氨酸一 锅法合成(5)-2-?基下酸 将实施实例2中D-乳酸脱氨酶工程菌的静息细胞换成1.6 g心乳酸脱氨酶工程菌的静 息细胞(湿重，133U)，反应36小时后，经处理得到浅黄色油状产品（5)-2-?基下酸7.57邑， 收率97%，ee值大于99%。4 NMR (400 MHz, CDC13): 8=4.26 (dd, J=6.7, 4.5 Hz, 1 H), 1.84 - 1.97 (m, 1 H), 1.76 (dquin, J=14.3, 7.2, 7.2, 7.2, 7.2 Hz, I H), 1.02 (t, J=7.5 Hz, 3 H). "C NMR (100 MHz, CDCb): 5=179.59，71.31，27.27，8.95. MS 化SI): m/z: calcd for C4H703-: 103.0395 [M-H]-， found: 103.0405. 实施实例4苏氨酸脱水酶、甲酸脱氨酶、D-乳酸脱氨酶=酶共表达重组菌静息细胞催 化苏氨酸一锅法合成(10-2-?基下酸(添加PLP) 在250血S口瓶中，依次加入99血水、8.93 g苏氨酸、3.58 g憐酸氨二钢、15.6 g甲酸 钢、1 ml 10 mM憐酸化唉醒与50 mg NA护，调节pH至7.0,然后加入2 g苏氨酸脱水酶、甲酸 脱氨酶、D-乳酸脱氨酶=酶共表达重组菌静息细胞，利用pH在线调控系统，向反应体系流加 2M盐酸，控制反应体系的抑维持在抑7.0左右，反应溫度控制在25~30°C。反应8小时后，高 效液相色谱检测显示反应完全(Agilent 1200 series册LC，Acclaim 120 C18 column (4.6X250 mm, 5.0皿)），6M盐酸调节抑至I~2,离屯、收集上层清液，分别用200 ml乙酸乙 醋萃取3次，合并有机相，无水硫酸钢干燥，过滤，旋蒸回收溶剂得浅黄色油状产品（R)-2-径基下酸7.25 g，收率93%，ee值大于99%。
[0023] 实施实例5苏氨酸脱水酶、甲酸脱氨酶a-乳酸脱氨酶=酶共表达重组菌静息细 胞催化苏氨酸一锅法合成(5)-2-?基下酸(添加PLP) 将实施实例4中苏氨酸脱水酶、甲酸脱氨酶、D-乳酸脱氨酶=酶共表达重组菌静息细胞 换成2.0 g苏氨酸脱水酶、甲酸脱氨酶a-乳酸脱氨酶=酶共表达重组菌静息细胞，反应24 小时后，经处理得到浅黄色油状产品（5)-2-?基下酸7.57 g，收率97%，ee值大于99%。
[0024] 实施实例6苏氨酸脱水酶、甲酸脱氨酶、D-乳酸脱氨酶=酶共表达重组菌静息细 胞催化苏氨酸一锅法合成(10-2-?基下酸(不添加PLP) 在实施实例4中不添加憐酸化唉醒，反应12小时后，经处理得到浅黄色油状产品（R)- 2-径基下酸7.49 g，收率96%，ee值大于99%。
[0025] 实施实例7苏氨酸脱水酶、甲酸脱氨酶a-乳酸脱氨酶=酶共表达重组菌静息细 胞催化苏氨酸一锅法合成(5)-2-?基下酸(不添加PLP) 在实施实例5中不添加憐酸化唉醒，反应24小时后，经处理得到浅黄色油状产品（S)-2-径基下酸7.41 g，收率95%，ee值大于99%。
【主权项】
1. 一种生物合成(R)-2-羟基丁酸与（S)-2-羟基丁酸的新方法，其特征在于利用苏氨酸 脱水酶、乳酸脱氢酶与甲酸脱氢酶或它们共表达重组菌催化苏氨酸一锅法制备(R)-2-羟基 丁酸或(S)-2-羟基丁酸，包括如下步骤： a) 苏氨酸脱水酶重组菌、甲酸脱氢酶重组菌和D/L-乳酸脱氢酶重组菌及三酶共表达重 组菌的构建； b) 将苏氨酸脱水酶重组菌、甲酸脱氢酶重组菌和D/L-乳酸脱氢酶重组菌及三酶共表达 重组菌分别在发酵培养基中扩增培养，并进行诱导产生目的蛋白后，离心收集菌体； c) 将收集的苏氨酸脱水酶重组菌、甲酸脱氢酶重组菌和D/L-乳酸脱氢酶重组菌或三酶 共表达重组菌，加入到含水、苏氨酸、磷酸氢二钠、甲酸钠、磷酸吡哆醛(PLP)与烟酰胺腺嘌 呤双核苷酸(NAD+)，调节pH至7.0,在适当条件下反应一定时间，底物经过中间产物2-丁酮 酸，最终转化为(R)-2-羟基丁酸或(S)-2-羟基丁酸； d) 反应用盐酸酸化中止后从反应体系中收集上层清液，并用乙酸乙酯萃取多次，合并 有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸回收溶剂得到目标产物。2. 如权利要求1所述的a)步骤产苏氨酸脱水酶、乳酸脱氢酶与甲酸脱氢酶的共表达基 因工程菌，其特征在于同时将苏氨酸脱水酶、D/L-乳酸脱氢酶与甲酸脱氢酶构建到同一个 载体上，并转化到宿主菌进行诱导表达。3. 如权利要求1所述的a)步骤产苏氨酸脱水酶、D/L-乳酸脱氢酶或甲酸脱氢酶的基因 工程菌，其特征在于将苏氨酸脱水酶、D/L-乳酸脱氢酶或甲酸脱氢酶构建到一个载体上，并 转化到宿主菌进行诱导表达。4. 如权利要求1所述的a)步骤产苏氨酸脱水酶、D/L-乳酸脱氢酶与甲酸脱氢酶的共表 达基因工程菌，其特征在于所述的能高效表达外源基因的质粒为下列之一:PET系列质粒、 pETduet系列pET系列质粒、pTXBl系列、pGEX系列、pETduet系列、pTYB系列；高效表达外源基 因的宿主菌为下列之一:BL21系列、Rosetta系列、Origami系列、Tuner系列。5. 如权利要求1所述的a)步骤产苏氨酸脱水酶、D/L-乳酸脱氢酶或甲酸脱氢酶的基因 工程菌，其特征在于所述的能高效表达外源基因的质粒为下列之一:pET系列质粒、pETduet 系列pET系列质粒、pTXBl系列、pGEX系列、pETduet系列、pTYB系列；高效表达外源基因的宿 主菌为下列之一 :BL21系列、Rosetta系列、Origami系列、Tuner系列。6. 如权利要求1所述的方法中c)步骤中，其中所述酶可以是完整的微生物细胞、细胞破 碎液、粗酶或纯酶。7. 如权利要求1所述的转化方法c)步骤，其特征在于所述的反应条件：温度为20~40 °C，优选25~30°C ;所用的缓冲液为磷酸盐、Tris硫酸盐;所用的缓冲液的pH为7.0~9.0，优 选pH为7.0;反应时间为8-36小时。8. 如权利要求1所述的转化方法c)步骤，其特征在于所述的苏氨酸的浓度为35.7~ 89.3 g/L〇
【专利摘要】本发明涉及(<i>R</i>)-2-羟基丁酸与(<i>S</i>)-2-羟基丁酸的生物合成新方法。更具体的，本发明提供了一种利用苏氨酸脱水酶、乳酸脱氢酶与甲酸脱氢酶催化苏氨酸一锅法生产(<i>R</i>)-2-羟基丁酸或(<i>S</i>)-2-羟基丁酸的方法，所述的(<i>R</i>)-2-羟基丁酸与(<i>S</i>)-2-羟基丁酸可广泛应用于药物合成、生物可降解材料及精细化学品的合成。本方法具有反应条件温和、无污染和工艺路线简单等显著特点。
【IPC分类】C12N15/70, C12P7/42
【公开号】CN105695519
【申请号】CN201610252919
【发明人】姚培圆, 崔云凤, 冯进辉, 吴洽庆, 朱敦明, 马延和
【申请人】中国科学院天津工业生物技术研究所
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2016年4月22日