一种用于结肠癌预后判断的方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于结肠癌预后判断的方法，包括检测一种多肽的氨基酸序列，所述氨基酸序列选自SEQ NO.1所示序列或选自与SEQ NO.1所示序列显示至少99％同一性的序列。本发明提供了一种结肠癌预后评估判断新标记物：HOXB?AS3多肽。临床研究证实，其在结肠癌组织中低表达或不表达与结肠癌患者预后差呈正相关，结肠癌组织中HOXB?AS3多肽低水平的患者具有更高的死亡率和更短的生存期。由此可知，采用HOXB?AS3多肽作为生物标志物有效地提高了临床中使用试剂盒进行结肠癌预后判断的阳性符合率。并且通过检测本发明的多肽在生物学样品组织切片中的水平，可有助于判断结肠癌的发生及其恶性程度和转移。
【专利说明】
一种用于结肠癌预后判断的方法及试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及肿瘤的诊断和治疗领域，具体而言，涉及一种用于结肠癌预后判断的 方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 结肠癌是世界上一种常见的消化系统恶性肿瘤，其发病率在各类肿瘤中排第3位。 全球每年新发病例约为120万例，每年死亡人数高达60万。近年来，随着人们生活水平的提 高，生活方式、饮食结构的改变，人口老龄化的加剧，结肠癌发病率在我国逐年上升，并且呈 现出年轻化的趋势，其发病率和死亡率分别位居我国肿瘤发病率和死亡率的第3和5位。
[0003] 早期局限性结肠癌患者的5年生存率可达90%，然而仅有不到40%的结肠癌患者 在早期得到确证。大多数结肠癌患者就诊时，其已经中晚期和大概40~50%发生了远处转 移，晚期结肠癌患者生存率则降到11%左右。随着结肠癌诊疗技术的不断发展，结肠癌的预 后有了很大的改善，但晚期结肠癌患者的预后仍然不尽如意。临床治疗失败的最主要原因 是结肠癌发生了转移或复发。因此，鉴定能用于提示结肠癌转移复发的新的标记物，有助于 临床上评估结肠癌患者的预后，判断手术切除后是否需要进一步的辅助治疗(如化疗）。
[0004] 目前，TNM分期是判断结肠癌患者预后的最重要临床预测指标。然而，许多结肠癌 患者即使TNM分期属于早期，肿瘤仍然发生转移和复发，说明部分目前临床诊疗技术上发现 没有发生转移的结肠癌，仍然存在转移复发的潜能。因此，很需要研究开发出更好的用于评 估结肠癌患者预后的新标记物。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明提供了一种用于结肠癌预后判断的方法，包括检测一种多肽的 氨基酸序列;所述氨基酸序列选自SEQ NO. 1所示序列或选自与SEQ NO. 1所示序列显示至少 99%同一性的序列。
[0006] 在某些实施方式中，所述的多肽为H0XB-AS3多肽。
[0007]在某些实施方式中，所述检测11(^8453多肽的抗原表位肽序列选自5￡〇勵.2或选 自与SEQ N0.2所不序列显不至少99 %问一性的序列。
[0008]在某些实施方式中，所述抗原表位肽的纯度>85%。
[0009]在某些实施方式中，所述抗原表位肽偶联有钥孔戚血蓝蛋白作为载体蛋白，增强 抗原表位肽的免疫原性。
[0010] 在某些实施方式中，所述检测一种多肽的氨基酸序列的步骤之前，还包括下列步 骤：
[0011] 提供分离的待测试的生物学样品；将所述生物学样品进行石蜡包埋并制成组织切 片。
[0012] 在某些实施方式中，所述检测一种多肽的氨基酸序列的步骤之后，还包括下列步 骤：
[0013] 依据所述羊抗兔二抗上偶联的二氨基联苯胺对所述组织切片中结肠癌细胞染色 的强度和面积进行评分;所述细胞染色的强度评分和所述细胞的染色面积评分相加，获得 H0XB-AS3多肽表达水平的最终评分;依据所述最终评分判断H0XB-AS3多肽在结肠癌组织中 表达水平，从而实现对结肠癌的诊断或预后判断。
[0014] 在某些实施方式中，还包括对结肠癌组织免疫组化染色切片进行成像的步骤。
[0015] 本发明还提供了一种用于结肠癌预后判断的试剂盒，所述试剂盒应用结肠癌预后 判断的方法进行结肠癌预后判断。
[0016] 本发明提供的一种用于结肠癌预后判断的方法及试剂盒的优点在于：
[0017] (1)提供一种结肠癌预后评估判断新标记物:H0XB-AS3多肽。临床研究证实，其在 结肠癌组织中低表达或不表达与结肠癌患者预后差呈正相关，结肠癌组织中H0XB-AS3多肽 低水平的患者具有更高的死亡率和更短的生存期。由此可知，采用H0XB-AS3多肽作为生物 标志物有效的提高了临床中使用试剂盒进行结肠癌预后判断的阳性符合率。
[0018] (2)本发明的多肽H0XB-AS3可作为结肠癌预后判断的生物标志物。并且通过使用 本发明的多肽的特异性抗体来检测本发明的多肽在生物学样品的组织切片中的水平，可有 助于判断结肠癌的发生及其恶性程度和转移。
[0019] (3)在本发明之前，还没有出现涉及本发明蛋白多肽用于结肠癌预后评估诊断的 公开报道，更没有出现证实H0XB-AS3长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)编码 一种活性多肽的公开报道，也就更没有出现H0XB-AS3多肽用于结肠癌预后评估诊断的公 开报道。
[0020] 综上所述，本发明具有上述诸多的优点及实用价值，并在同类产品中未见有类似 的方法公开发表或使用而确属创新。
【附图说明】
[0021] 应当理解的是，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范 围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些 附图获得其他相关的附图。
[0022]图1为本发明实施例2中抗H0XB-AS3抗体能够特异识别和检测H0XB-AS3多肽的结 果图；
[0023]图2为本发明实施例3的H0XB-AS3多肽在同一来源不同侵袭转移潜能结肠癌细胞 中表达的结果；
[0024]图3为本发明实施例4的H0XB-AS3多肽在3对新鲜冰冻成对的结肠癌组织与其对应 癌傍结肠组织中的结果。
[0025]图4本发明实施例5中H0XB-AS3多肽在结肠癌和对应癌傍正常结肠组织中表达的 示意图；图4a表示对应癌傍正常结肠组织；图4b表示结肠癌组织；
[0026]图5为本发明实施例5的H0XB-AS3多肽在90对成对的结肠癌组织与其对应癌傍结 肠石蜡组织中表达结果；
[0027]图6为本发明实施例5中H0XB-AS3多肽表达水平高低与结肠癌患者死亡率关系的 结果；
[0028]图7为本发明实施例5中H0XB-AS3多肽不同表达水平对结肠癌患者预后判断的 Kaplan-Meier分析曲线图。
【具体实施方式】
[0029]下面结合具体实施例的方式对本发明的权利要求做进一步的详细说明，在下面的 描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。
[0030] 但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以 在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
[0031] 本发明提供了一种用于结肠癌预后判断的方法，包括检测一种多肽的氨基酸序 列;所述氨基酸序列选自SEQ NO. 1所示序列或选自与SEQ NO. 1所示序列显示至少99%同一 性的序列。
[0032]进一步的，所述的多肽为H0XB-AS3多肽。
[0033]上述，需要理解的是，提供一种结肠癌预后评估判断新标记物:H0XB_AS3多肽。临 床研究证实，其在结肠癌组织中低表达或不表达与结肠癌患者预后差呈正相关，结肠癌组 织中H0XB-AS3多肽低水平的患者具有更高的死亡率和更短的生存期。由此可知，采用H0XB-AS多肽作为生物标志物有效的提高了临床中使用试剂盒进行结肠癌诊断或预后判断的阳 性符合率。
[0034]可以理解的是，本发明的多肽H0XB-AS3可作为结肠癌预后判断的生物标志物。并 且通过使用本发明的多肽的特异性抗体来检测本发明的多肽在生物学样品的组织切片中 的水平，可有助于判断结肠癌的发生及其恶性程度和转移。
[0035]在本发明之前，还没有出现涉及本发明蛋白多肽用于结肠癌预后评估诊断的公 开报道，更没有出现证实H0XB-AS长链非编码RNA(long non-coding RNA，IncRNA)编码一种 活性多肽的公开报道，也就更没有出现H0XB-AS3多肽用于结肠癌预后评估诊断的公开报 道。
[0036]进一步的，所述检测H0XB-AS3多肽的抗原表位肽序列选自SEQ如.2或选自与5￡〇 N0.2所不序列显不至少99 %问一性的序列。
[0037]进一步的，所述抗原表位肽的纯度>85%。
[0038] 进一步的，所述抗原表位肽偶联有钥孔戚血蓝蛋白KLH作为载体蛋白，增强抗原表 位肽的免疫原性。
[0039] 进一步的，所述检测一种多肽的氨基酸序列的步骤之前，还包括下列步骤：
[0040] 提供分离的待测试的生物学样品；将所述生物学样品进行石蜡包埋并制成组织切 片。
[0041] 进一步的，所述检测一种多肽的氨基酸序列的步骤之后，还包括下列步骤：
[0042]依据所述羊抗兔二抗上偶联的二氨基联苯胺(DAB)对所述组织切片中结肠癌细胞 染色的强度和面积进行评分;所述细胞染色的强度评分和所述细胞的染色面积评分相加， 获得H0XB-AS3多肽表达水平的最终评分;依据所述最终评分判断H0XB-AS3多肽在结肠癌组 织中表达水平，从而实现对结肠癌的诊断或预后判断。
[0043] 进一步的，还包括对结肠癌组织免疫组化染色切片进行成像的步骤。
[0044] 本发明还提供了一种用于结肠癌预后判断的试剂盒，该试剂盒应用于结肠癌预后 判断的方法进行结肠癌预后判断。
[0045] 为了便于理解本发明，下面结合实施例来进一步说明本发明的技术方案。
【申请人】 声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局 限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺 流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各 原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开 范围之内。
[0046] 实施例1
[0047]为说明制备抗H0XB-AS3抗体，和检测制备的抗H0XB-AS3抗体的效价，具体操作过 程如下：
[0048] (1)将设计的针对H0XB-AS3多肽的抗原表位肽进行化学合成（吉尔生化(上海)有 限公司），然后合成的抗原表位肽偶联钥孔戚血蓝蛋白作为免疫抗原，此免疫抗原采用高压 液相色谱(HPLC)进行纯化。
[0049] 取2只体重不小于2kg新西兰兔分别命名为兔1和兔2。各采集上述兔耳动脉血液2 ~3ml，分离获得血清，该血清即为阴性对照血清。
[0050] (2)上述纯化后的免疫抗原进行免疫抗原多点注射。具体过程如下：
[0051]首先，将钥孔戚血蓝蛋白偶联的抗原表位肽，用PBS溶解，然后按照质量1:1等比与 弗氏完全佐剂（Freund's complete adjuvant，FCA)，或者弗氏不完全佐剂（Freund's incomplete adjuvant，FIA)混合乳化。
[0052]其次，FCA乳化的500ug免疫抗原在新西兰兔背部进行多点注射。2周后，再在兔子 背部多点注射FCA乳化的500ug免疫抗原。2周后再用FIA乳化的250ug免疫抗原在新西兰兔 背部进行多点注射。之后每隔1周，用FIA乳化的250ug免疫抗原在新西兰兔背部进行多点注 射，共进行4次。
[0053] (3)免疫抗原多点注射过程结束前1周，通过耳动脉收集兔血液2~3ml，分离纯化 出血清，进行酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)分析，判 断制备的抗体效价。
[0054]同时，上述分离纯化得到的兔耳血清与上述的免疫抗原进行亲和纯化，从而获得 抗H0XB-AS3抗体。
[0055] (4)用roS缓冲液将此免疫抗原稀释到5μg/ml，96孔板的相应每孔中加100ul稀释 好的免疫抗原，4°C过夜。过夜后将孔中液体拍掉，用蒸馏水洗上述96孔板3次。然后，每孔加 200ul封闭液(PBS，1 %BSA，0.05%TWEEN-20)，37°C恒温箱孵育2小时。之后，拍掉96孔板孔 中液体，用蒸馏水洗96孔板5次。每孔加100ul样品稀释液(稀释比例分别为1:3125，1:6250， 1:12500，1: 25000，1:50000，样品稀释液为2%的BSA溶液）。上述阴性对照血清稀释比例1: 3000每孔加100ul，37°C恒温箱孵育1小时，用蒸馏水洗96孔板5次。每孔加100ul辣根过氧化 物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG(HRP_labeled goat anti-rabbit IgG)稀释液，稀释比例为1: 5000，37°C恒温箱孵育45分钟，用蒸馏水洗96孔板5次。每孔加100ul底物四甲基联苯胺 (TMB)显色液，室温下放置5~8分钟，加2M硫酸终止反应。然后再酶标仪上读板。
[0056]由表1结果可知，基于兔1和兔2制备的抗H 0 X B - A S 3多肽的抗体效价均大于1: 50000，效价的测定结果均较好，抗体效价均比较高，从而获得了高效价的抗H0XB-AS3多肽 抗体。
[0057] 表1抗H0XB-AS3抗体效价测定结果
[0058]
[0059] 实施例2
[0060] 抗H0XB-AS3抗体对H0XB-AS3多肽的特异性检测，具体步骤如下：
[0061 ] 构建H0XB-AS3-GFP融合基因表达载体。在其中，野生型GFP(GFPwt)基因翻译启动 子ATGGTG被突变为ATTGTT (GFPmut)，从而破坏了GFP基因的单独翻译，变成利用H0XB-AS3基 因上的翻译启动子ATG进行翻译，产生H0XB-AS3-GFP融合蛋白。利用脂质体Lipo2000(Life techno logy)转染HeLa细胞(ATCC，Number: CCL-2) 24小时后，分别利用抗GFP抗体和上面制 备的抗H0XB-AS3多肽的抗体，采用免疫印迹的方法，检测H0XB-AS3-GFP蛋白的表达。结果如 图la所示，抗GFP抗体和抗H0XB-AS3抗体均分别可以特异检测到此H0XB-AS3-GFP融合蛋白 的表达。然而采用阴性对照血清(pre-serum)进行相应的免疫印迹检测，则不能检测到蛋白 条带。并且抗H0XB-AS3抗体检测到的H0XB-AS3-GFP融合蛋白条带位置与抗GFP抗体检测到 的H0XB-AS3-GFP融合蛋白条带位置完全一致，说明抗H0XB-AS3抗体特异检测到了 H0XB-AS3 多肽。以检测0-actin作为内参。
[0062] 进一步，采用针对H0XB-AS3的2个siRNA#l和siRNA#2沉默结肠癌细胞SW480(ATCC， Number: CCL-228)中H0XB-AS3基因的表达，采用免疫印迹的方法，检测H0XB-AS3多肽的表达 水平。通过采用反转录一基因扩增技术(RT-PCR)发现siRNA沉默结肠癌细胞SW480细胞中 H0XB-AS3RNA的表达水平后，结果参见图lb，用抗H0XB-AS3抗体检测siRNA沉默前后细胞内 H0XB-AS3多肽水平的变化，发现H0XB-AS3多肽水平显著降低。也说明制备的抗H0XB-AS3抗 体能够特异识别和检测H0XB-AS3多肽，结果见图lc。以检测P-actin作为内参。
[0063] 实施例3
[0064] 采用免疫印迹的方法，利用上面制备的抗H0XB-AS3抗体检测H0XB-AS3多肽在同一 来源不同侵袭转移潜能结肠癌细胞中的表达水平，具体步骤如下：
[0065]采用此抗H0XB-AS3抗体，利用免疫印迹方法检测了 2对同一来源不同侵袭转移潜 能结肠癌细胞 SW480 与 51620(六10：，_11^6厂分别为0^-228和0(^-228)、111'(：-116(410：， Number:CCL-247)和HTC-116 high(此细胞由本实验室前期筛选建立)之间H0XB-AS3多肽水平 的差异，发现H0XB-AS3多肽水平在高侵袭转移潜能结肠癌细胞SW620和HTC-116 high*下调， 结果见图2,以检测P-actin作为内参。
[0066] 实施例4
[0067]收集2015年在广州医科大学附属第三医院确诊为结肠癌并手术切除患者3名，取 其肿瘤组织及对应癌傍正常组织。所有结肠癌患者术前均未接受任何抗肿瘤治疗，并且未 患有其它肿瘤疾病，全部为男性，年龄62.3 ± 5.6岁。
[0068]采用液氮分别研磨结肠癌和癌傍正常结肠组织，裂解研磨后的组织，提取组织细 胞蛋白。利用上面制备的抗H0XB-AS3多肽抗体，采用免疫印迹的方法，检测H0XB-AS3多肽在 此3对结肠癌组织与其对应癌傍正常结肠组织中的水平差异。
[0069] 结果如图3所示，相对于癌傍正常结肠组织，H0XB-AS3多肽水平在结肠癌组织中下 调。以检测0-actin作为内参。
[0070] 实施例5
[0071]为进一步证明大规模临床样品中H0XB-AS3多肽水平与结肠癌病理学特征和结肠 癌患者生存期之间的关系，具体过程如下：
[0072]采集确诊为结肠癌患者的（男48例，女42例，年龄69.7± 11.1岁）结肠癌组织以及 其对应癌傍正常结肠组织，并制作成组织芯片(上海芯超公司，HCol-Adel80Sur-06)。
[0073]采用免疫组化SP法。具体步骤如下：将结肠癌组织及配对的癌傍正常结肠组织的 组织芯片常规脱蜡水化，置入ImM EDTA(pH 8.0)缓冲液中，用高压蒸汽修复法进行抗原修 复。然后，冷却至室温，利用3%的H2〇2阻断内源性过氧化物酶，孵育ISmiruPBS缓冲液(2%) 冲洗3次，每次3min。然后，滴加山羊血清封闭液，室温下孵育25min。再滴加50ul上面制备的 抗H0XB-AS3抗体（1:300)，4°C孵育过夜，PBS缓冲液(2 % )冲洗5次，每次5min。再滴加50ul HRP标记的羊抗兔Ig G(二抗）（1:2000)，室温孵育45min，PBS缓冲液（2%)冲洗5次，每次 5min，二氨基联苯胺(Diaminobenzidine，DAB)显色1~3min，苏木素复染，常规脱水透明，中 性树胶封片。
[0074]依据本实验室前期建立的半定量免疫组化结果判断方法，分析免疫组化染色图 片。
[0075] 具体为:依据染色强度，无棕黄色为0分;淡棕黄色为1分;棕黄色为2分;棕褐色为3 分。相同物镜下观察阳性细胞数，无阳性细胞数为〇分；阳性细胞数< 1 〇 %为1分；阳性细胞 数11 %~50%为2分；阳性细胞数>50%为3分。
[0076] 将染色强度得分和阳性细胞数百分比的得分相加，即为此样品的H0XB-AS3表达水 平的得分。H0XB-AS3的结肠癌组织样品得分与对应癌傍正常结肠组织得分相比，小于1即表 示H0XB-AS3在结肠癌组织中低表达（low)，其它则为高表达(high)。结果如图4所示，图4是 本发明实施例5的H0XB-AS3多肽在结肠癌组织和其对应癌傍正常结肠组织中的表达水平结 果。其中，图4a表示对应癌傍正常结肠组织（Adjacent tissues)，图4b表示结肠癌组织 (Cancer tissues)。
[0077] 采用SPSS12.0统计软件包分析，GraphPad Prism 5软件绘图，H0XB-AS3多肽的结 肠癌组织与对应癌傍正常结肠组织得分用Mann-Whitney U test方法进行统计分析。结果 如图5所示，与对应癌傍正常结肠组织(N)相比，H0XB-AS3多肽水平在结肠癌组织(T)中显著 下调(p〈0.0001)。
[0078] 在此基础上，依据H0XB-AS3多肽表达水平，以H0XB-AS3的结肠癌组织样品得分与 对应癌傍正常结肠组织得分相比，小于1即表示H0XB-AS3在结肠癌组织中低表达（low)，其 它则为高表达(high)，从而分成H0XB-AS3高低表达2组。进一步评估了 H0XB-AS3多肽水平与 结肠癌病理学指标的相关性，包括病人的性别，年龄，组织分级(Histological Grade)，T分 期(pT status)，N分期（pN status)，临床分期(Clinical stage)。结果如表2所示，我们发 现H0XB-AS3多肽低表达组具有更差的临床分期(p = 0.037)。
[0079]表2 H0XB-AS3多肽水平与结肠癌病理学特征之间的相关性
[0082] *平均年龄
[0083] #American Joint Committee on Cancer classification(Version 7)(AJCC) [0084] 进一步，依据上面的H0XB-AS3表达水平高低分组，我们发现H0XB-AS3高表达 (high)结肠癌患者只有37.48 %的死亡率，而H0XB-AS3低表达（low)结肠癌患者高达 75.47 %的死亡率，H0XB-AS3低表达结肠癌患者组的死亡率是H0XB-AS3高表达结肠癌组死 亡率的2倍多（结果见图6)。进而采用Kaplan-Meier法和log-rank检验，分析了 H0XB-AS3表 达高低与结肠癌患者生存期的相关性。结果如图7所示，H0XB-AS3低表达结肠癌患者组存活 率更低、预后更差化〈〇.〇〇〇1)4(^8453低表达结肠癌患者平均存活时间为46个月，而 H0XB-AS3高表达结肠癌患者平均存活时间为75个月。
【主权项】
1. 一种用于结肠癌预后判断的方法，其特征在于:包括检测一种多肽的氨基酸序列;所 述氨基酸序列选自SEQ NO. 1所示序列或选自与SEQ NO. 1所示序列显示至少99%同一性的 序列。2. 如权利要求1所述的用于结肠癌预后判断的方法，其特征在于：所述的多肽为H0XB-AS3多肽。3. 如权利要求1所述的用于结肠癌预后判断的方法，其特征在于:所述检测H0XB-AS3多 肽的抗原表位肽序列选自SEQ NO.2或选自与SEQ NO.2所示序列显示至少99%同一性的序 列。4. 如权利要求3所述的用于结肠癌预后判断的方法，其特征在于:所述抗原表位肽的纯 度 >85%。5. 如权利要求3所述的用于结肠癌预后判断的方法，其特征在于:所述抗原表位肽偶联 有钥孔戚血蓝蛋白作为载体蛋白，增强抗原表位肽的免疫原性。6. 如权利要求5所述的用于结肠癌预后判断的方法，其特征在于:所述检测一种多肽的 氨基酸序列的步骤之前，还包括下列步骤： 提供分离的待测试的生物学样品;将所述生物学样品进行石蜡包埋并制成组织切片。7. 如权利要求6所述的用于结肠癌预后判断的方法，其特征在于:所述检测一种多肽的 氨基酸序列的步骤之后，还包括下列步骤： 依据所述羊抗兔二抗上偶联的二氨基联苯胺对所述组织切片中结肠癌细胞染色的强 度和面积进行评分;所述细胞染色的强度评分和所述细胞的染色面积评分相加，获得H0XB-AS3多肽表达水平的最终评分;依据所述最终评分判断H0XB-AS3多肽在结肠癌组织中表达 水平，从而实现对结肠癌的预后判断。8. 如权利要求1~7中任意一项所述的用于结肠癌预后判断的方法，其特征在于:还包 括对结肠癌组织免疫组化染色切片进行成像的步骤。9. 一种用于结肠癌预后判断的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒应用权利要求1~7中 任意一项所述的用于结肠癌预后判断的方法进行结肠癌预后判断。
【文档编号】G01N33/574GK106053837SQ201610544113
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月8日
【发明人】晏光荣, 黄金舟, 陈敏
【申请人】广州医科大学附属第三医院