一种用于自身免疫病检测的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于自身免疫病检测的试剂盒。SLE是一种弥漫性、全身性的自身免疫性疾病,主要发病机理是自身抗体和免疫复合物的形成,疾病发展过程中常累及多个器官和系统。现有技术的检测方法具有一定的局限性，不适宜廉价的大面积推广。本发明提供的试剂盒能够通过检测血液来鉴定时候患有系统性红斑狼疮，从而能够快速高效的检测SLE。该试剂盒制备简单。
【专利说明】
一种用于自身免疫病检测的试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于自身免疫病检测的试剂盒。
【背景技术】
[0002] Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)是固有免疫细胞的经典模式识别受体， 其识别病原相关分子模式，启动固有免疫应答，并决定后继的适应性免疫应答方向和反应 强度，因而受到机体免疫系统的严格调控。TLR信号的免疫调控包括负调控和正调控，而髓 样细胞表达触发受体（Triggering receptor expressed on myeloid cells，TREM)家族是 一类新发现的免疫球蛋白超家族的成员、TLR信号免疫调控分子，可通过放大或抑制TLR信 号从而调控免疫应答反应强度，避免过度炎症反应和自身免疫性疾病的发生。目前TREM家 族包含了TREM-1、TREM-2、TREM-3、TREM样转录因子1 (TREM 1 ike transcript 1，TLT-1)和 TLT-2多个受体成员，其中TREM-1能加强炎症反应、正向调控自身免疫性疾病的发生发展； 与此相反，TREM-2在自身免疫中主要发挥负调控作用，可调节多种细胞的分化成熟;而对于 TLT-1，目前更多的认为它是一类激活型受体，参与血小板活化、聚集的过程;相似的，TLT-2 可促使白细胞活化，对T细胞有刺激作用。TREM-1是2000年报道的TREM家族激活型受体，并 且随着对其作用机制的研究，发现其在部分自身免疫性疾病的发生发展中发挥着重要的作 用，现就TREM-1分子及其在自身免疫性疾病中的研究进展作一综述。
[0003] 目前研究发现TREM基因定位于人6号染色体。Bouchon等首先发现TREM-1表达于外 周血中的中性粒细胞、单核细胞等固有免疫细胞表面，是由234个氨基酸组成的跨膜糖蛋 白，其中包括了由单独免疫球蛋白V型结构域组成的胞外区、含赖氨酸残基的跨膜区及缺乏 固有信号域的胞内区。近年来越来越多的研究显示TREM-1也可表达在自然杀伤细胞、树突 状细胞、呼吸道上皮细胞、肝脏内皮细胞等。
[0004] TREM-1主要是以膜表面分子和可溶性分子（Soluble TREM-l，sTREM-l)两种表达 形式存在。膜表面的TREM-1分子根据其结构特点与配体结合后，激活一系列的信号通路，调 控炎症反应及诱导免疫应答。目前对于sTREM-1的来源有两种假设:一是TREM-1剪切变异的 缺乏跨膜区的分泌亚型，二是膜表面TREM-1蛋白水解机制下的结果，而且实验证明在细菌 脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)刺激下的人单核细胞和中性粒细胞的培养中，金属蛋 白酶抑制剂可增加细胞表面TREM-1的稳定性、减少sTREM-1的释放[5]。尽管TREM-1的天然 配体尚未完全确定，但有研究推测其表达在人血小板表面及实验性腹膜炎、内毒素血症小 鼠模型中的粒细胞表面，但要得到确切的答案，仍需进一步的研究证实。
[0005] 现有技术已经有大量的证据表明TREM-1与系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus，SLE)是有极大的相关性的。SLE是一种弥漫性、全身性的自身免疫性疾病， 主要发病机理是自身抗体和免疫复合物的形成，疾病发展过程中常累及多个器官和系统。 SLE的病因及发病机制复杂，临床表现多样，感染是疾病触发的原因之一，同时也是发病过 程中加重病情的常见因素。有研究将SLE发热患者分为疾病活动组和合并感染组，通过检测 患者血清中sTREM-1水平发现合并感染患者明显高于疾病活动患者。而最新的一个研究报 道指出，sTREM-1在SLE患者血清中表达上调。
[0006] 现有技术中检测TREM-1蛋白的量一般通过抗体结合之后通过酶联免疫反应进行 定量检测，但是该检测方法需要自备相应的抗体，由于抗体的制备要求比较高，并且制备复 杂，在检测中存在着巨大的局限。
[0007] SELEX技术是20世纪90年代初发展起来的一种新的组合化学技术。利用该技术可 以从随机单链寡核苷酸库中筛选到特异性与靶物质高度亲和的核酸适配体。其基本思路是 体外化学合成一个单链寡核苷酸库，与靶物质混合，形成靶物质-核酸复合物，洗脱未结合 的核酸，分离与靶物质结合的核酸分子，并以此核酸分子为模板进行PCR扩增，再进入下轮 的筛选。通过重复的筛选与扩增，一些与靶物质不结合或与靶物质有低亲和力、中亲和力的 核酸分子被洗去，而与革G物质有强未和力的核酸分子从非常大的随机库中分尚出来，且纯 度随SELEX过程的进行而增高，最后占据库的大多数（>90%左右）。自Tuerk和Ellington等 首先运用此技术筛选到特异性吸附噬菌体T4DNA聚合酶和有机染料分子的特异核酸适配体 后，经过十几年的发展，SELEX技术已经成为一种重要的研宄手段和工具。因此，采用selex 技术，筛选特定的结合TREM-1的适配体具有较为重要的意义。
【发明内容】
[0008] 本发明的技术方案通过以下步骤实现：
[0009] 本发明的目的是提供一种TREM-1的核酸适配体序列。
[0010] 本发明中，所述的TREM-1的核酸适配体(序列1-24)能够特异结合TREM-1。
[0011] 本发明的进一步的目的是提供所述核酸适配体序列的用途。本发明中根据对该序 列应用，可进一步用于制备特异性结合TREM-1的试剂盒。
[0012] 从体外合成的随机寡聚DNA文库，（5 '-CGTTAAGACGAGTTGGCCAG-N36-AATGACCAGTGAAGCTTGAC-3'），其中N36为36个随机寡核苷酸;从中筛选出与TREM-1特异结合 的核酸适配体；将筛选出的序列用引物PI : CGTTAAGACGAGTTGGCCAG;引物P2 : GTCAAGCTTCACTGGTCATT，进行扩增并进行TA克隆入pMD19-T载体(购自上海博光生物公司）， 转化DH5a细菌(购自北京天根生物公司）；挑去白色菌落进行PCR确定阳性克隆后，抽提质粒 并测序反应，上测序仪测序。
[0013]本发明采用核酸适配体的体外筛选（SELEX)技术，以TREM-1为正筛靶标筛选与 TREM-1特异结合的核酸适配体，制得具有特异结合TREM-1的序列，本发明中命名为适配体 TREM-1-1~24。序列如下：
[0039] 本发明的适配子可以用于构建试剂盒，该试剂盒可以用于特异性的分离和定量检 测TREM-1〇
[0040] 本发明的有益效果:获得了一种能够特异检测TREM-1的试剂盒，该试剂盒成本低 廉，可以大面积推广使用。
【具体实施方式】
[0041] 实施例1:蛋白的获得
[0042] 人 TREM-1:DAP12 稳定细胞系的产生 BWZ.36/hTREM-l:DAP12:NFAT-LacZ 细胞系（本 文亦称为〃 BWZ/hTREM-I报道细胞〃)来源于BW5147T细胞(小鼠Ofes胸腺淋巴瘤细胞系，ATCC TIB-47，LGC Standards，Middelsex，UK)，并含有受4拷贝NFAT启动子元件调节的LacZ报道 构建体（参见Karttunen，J?和Shastri，N. (1991 )Proc .Natl .Acad. Sci .USA 88,3972-3976 及Fiering，S. ，Northrop，J.P. ，Nolan，G.P. ，Matilla，P. ，Crabtree，G.R?和 Herzenberg，L? A?( 1990)Genes Dev.4,1823-1834)。使用Superfect转染试剂（目录号 301305，Qiagen Nordic，Denmark)，将使用TREM-1 cDNA(Gene Bank Ref.ID:NM_018643.2， Sino Biological Inc.，Beijing, China)作为模板和寡聚 5' TAGTAGGGATCCGCTGGTGCACAGGAAGG和5 ' TAGTAGGCGGCCGCTTCGTGGGCCTAG GGTAC作为引物克 隆至pIREShyg载体GenBank登录号U89672(目录号6061-1，Clontech Laboratories，CA， USA)的TREM/DAP12/pMX-IRES载体（自 Smal位点至BamHI位点编码786bp TREM-1)转染到 PLAT-E包装细胞系（由W.Yokoyama,Washington University提供；或者，目录号RV-101，RV-101，Cell Biolabs Inc,Bio-Mediator KY，Vantaa，Finland)。如下使用含有TREM/DAP12/ pMX-IRES病毒颗粒的PLAT-E上清液来感染BWZ.36细胞:将2xl0 5个BWZ.36细胞在6孔板中培 养，更换培养基为1.5ml含有病毒颗粒+8mg/ml聚凝胺(polybrene)的上清液。6-8小时后，将 1.5ml正常培养基加到板中，使细胞再温育24小时。将稳定表达TREM-I的BWZ.36细胞系用抗 TREM-I单克隆抗体(克隆21C7)染色，并通过细胞分选来分离。将分离得到的细胞进行培养， 收获得到TREM-1蛋白，富集蛋白使得蛋白浓度为100mg/mL，4度贮存。
[0043]实施例2核酸适配体筛选
[0044] 从体外合成的随机寡聚DNA文库，（5 '-CGTTAAGACGAGTTGGCCAG-N36-AATGACCAGTGAAGCTTGAC-3 '），其中N36为36个随机寡核苷酸；
[0045] 引物PI: CGTTAAGACGAGTTGGCCAG;引物P2 :GTCAAGCTTCACTGGTCATT。
[0046] (l)TREM-l蛋白 lmg溶于200yl PBS后加入96孔ELISA板中，4°C过夜。
[0047] (2)蛋白包被孔用PBS洗涤6次后，加入200yl 3%BSA(购自上海生工），孵育2小时。 同时，空白96孔ELISA板中加入200yl 3%BSA 37°C孵育2小时。
[0048] (3)将随机 ssDNA 文库（首轮用量为 800pmol)溶于 200yl 1*SHCMK，95°C 变性 5min。 立即置于冰上l〇min，使其迅速降至室温，避免ssDNA复性成双链。
[0049] (4)将ssDNA加入PBS洗涤6次的空白ELISA孔中，37°C孵育2小时。
[0050] (5)上清转入PBS洗涤6次的蛋白包被孔中，37 °C孵育2小时后PBS洗涤6次。
[00511 (6)结合了 ssDNA的酶标孔用200微升洗脱缓冲液重悬，95°C加热5min，取上清，经 过乙醇沉淀DNA，溶于Mi 11 ipore水中，作为下一轮筛选的模板。
[0052] (7)取5yl PCR产物上样于5wt%琼脂糖(购自上海生工），观察条带位置是否正确。 从首轮之后，投入的ssDNA次级库的量逐渐减少，如此反复进行12个循环。
[0053]第12轮筛选产物的扩增和纯化:将第12轮筛选得到的ssDNA序列，用引物P1，引物 P2进行扩增。100yl PCR扩增后体系加入600pl结合液BB(20mmol/L Hepes(pH7.35)， 100mmol/L NaCl，5.5mmol/L KCl，1.5mmol/L CaCl2，lmmol/L MgCl2，l%BSA)，充分混匀。将 上一步所得溶液加入吸附柱EC中（吸附柱放入收集管中），室温放置lmin，12000rpm离心 60s，倒掉收集管中的废液。加入700pmol漂洗WB(结合液BB+0 ? 05%Tween20)，12000rpm离心 30s，弃掉废液。加入500pmol漂洗液WB，12000rpm离心30s，弃掉废液。将吸附柱EC放回空收 集管中，12000rpm离心2min。取出吸附柱EC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部 位加20pmo 1 65 °C水浴预热的洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12，OOOrpm离心lmin。将得到的 溶液重新加入吸附柱中，再次离心lmin。
[0054] PCR纯化产物的克隆：取lyl扩增产物，与载体PGM-T在T4DNA连接酶的作用下连接， 再将其转化到感受态细胞，取适当体积均匀涂布于含有IPTG、x-gal、抗生素(Amp)的LA平 板，倒置培养皿，于37°C培养12-16小时进行"蓝-白斑筛选"。测序：用接种环挑取筛选平板 上的单个白色菌落于含Amp的LB液体培养基，37°C培养过夜。取菌液lml于离心管中，封膜后 送上海生工测序。
[0055]测序结果发现其中有24个核酸适配体序列与TREM-1具有非常强的亲和性，该24个 序列分别是:SEQ ID N0:1-24所示。
[0056]实施例3特异性高亲和力的TREM-1结合适配子的性能测定 [0057] 将适配子分别取1.5iig，用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)37°C消化lh，纯化回收去磷酸 化的RNA;通过T4多核苷酸激酶标记[y-32P]ATP于去磷酸化的适配体分子末端。lOnmol放 射性标记的适配子分别与不同浓度（l-200nM)的TREM-1蛋白37°C孵育30min，各组反应液经 硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样品 平行做两次测定。计算各个适配子与TREM-1蛋白的解离常数。结果如下：
[0060]从以上结果可以看出，本发明的24个适配子具有非常强的结合特性，现有技术中 也没有所述结合特性的适配子能够结合TREM-1蛋白。
[00611实施例4降解活性分析
[0062] 分别采用人血白蛋白，TREM-1、TREM-2、TREM-3、TLT-1和TLT-2分别与24条适配子 进行特异性检测，经过结合试验发现，这些适配子都不与这些蛋白相结合，而只与TREM-1蛋 白结合保持较高的特异性。
[0063] 将所述的适配子，取0.2ug，分别置于常温的血清、水溶液中，放置四周。通过RT-PCR检测，发现三周的放置其结构稳定，没有被降解。
[0064]实施例5临床试验分析
[0065]取50组临床血清样本，分别为：SLE发热疾病活动组20例，SLE发热合并感染组20 例，10例为正常人。
[0066] 将24个适配子分别与标准品TREM-1蛋白通过免疫磁珠分离的方式构建标准品检 测的标准曲线。然后将50组临床血清样本分别去10yl加入到无菌离心管中，加入PBS溶液震 荡溶解。分别将偶联有磁珠的24组适配子与50组的血清溶液混合孵育20分钟（一种适配子 对应检测50组血清样本），而后磁分离，即可获得相应的分离的TREM-1蛋白，通过标准曲线 浓度检测获得相应的蛋白浓度结果，通过检测，针对同一个血清，各适配子检测出的浓度几 乎没有差距;而各组之间的浓度存在明显的差异，以正常人的蛋白浓度的平均值作为对照， 结果如下：
[0068]从以上结果可以看出，SLE发热合并感染组的TREM-1蛋白浓度显著的增加，与正常 人之间可以显著的区分开来。说明本发明的适配子可以用于检测分析。
[0069] 实施例6TREM-1分子阻断性检测
[0070] 根据现有技术的方法，鉴定适配子时候阻断TREM-1:包括(a)培养表达TREM-1、信 号转导蛋白和报道构建体的第一细胞；（b)在将第一细胞与激活性化合物（例如TREM-1配 体)或激活的嗜中性粒细胞一起温育时测量所述细胞的活性；（c)使第一细胞和激活性化合 物(例如TREM-1配体)或激活的嗜中性粒细胞的共培养物与TREM-I适配子接触；和(d)测得 第一细胞的活性小于(b)中测量的活性。根据所述的方法，
【申请人】通过检测发现，24中适配 子均可以阻断TREM-1的活性。
[0071]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种用于检测自身免疫病的试剂盒，其特征在于：其包含能特异性结合TREM-1蛋白 的核酸适体。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述核酸适体为SEQ ID No. 1-24任一条序 列所示，或者在该序列的基础上进行的一个或几个核苷酸的替换，并保留其活性。3. 权利要求1-2任一项所述的试剂盒在检测自身免疫病损伤的应用。4. 权利要求1-2任一项所述的试剂盒用于制备检测系统性红斑狼疮的试剂中的应用。
【文档编号】G01N33/68GK106053831SQ201610393707
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月5日
【发明人】潘时辉
【申请人】潘时辉