上皮癌的诊断和预后方法

专利名称：上皮癌的诊断和预后方法
上皮癌的诊断和预后方法 相关申请的交互参考
本申请根据35U.S.C. §119问条，要求2005年1月28曰 提交的美国临时专利申请号60/648,110的权益。政府支持
本工作受的美国国家卫生研究所的支持，资助号(grant number) 2R37 CA37393。政府对本发明拥有一定的权利。发明背景
癌症生存中的最重要的因素之一是在早期阶段被检测。测 定癌症早期事件的临床分析提供干预和预防癌症发展的机会。随着 基因i普(gene profilmg)和蛋白质组学(proteomics)的发展，可用于诊断 和预测疾病的结局的特异性癌症的分子标记物或"生物标记物"的 鉴定取得显著进展。例如，在前列腺癌的病例中，抗原PSA(针对前列腺的特异性抗原)可在血液中被测定出并为前列腺癌存在的指示 物。因而，可对处于前列腺癌风险的人的血液进行PSA水平升高的快速、容易和安全的筛查。
即使在癌症检测领域已经取得显著进展，但是在该领域仍 然存在可易于应用于临床的对于多种癌症的新的生物标记物鉴定的 需求。例如，目前使用可易于测定的生物标记物诊断乳腺癌的可利 用选项相当地少。EGFR的过度表达，尤其是与向下调节的雌激素受 体偶合的EGFR的过度表达，是乳腺癌患者中预后差的标记物。乳 腺癌的其它已知标记物包括血液中的高水平的M2丙酮酸激酶(M2 PK)(美国专利号6,358,683)、血液中的高的2NF217蛋白质水平(WO98/02539)和用于诊断的、乳腺癌中的新近鉴定的蛋白质PDEBC的分 化表达(美国专利申请号20030124543)。细胞表面标记物诸如CEA、 CA-125和HCG在局部晚期和转移的膀胱癌患者的血清中常常是升 高的(Izes等，JUrol.Jun; 165(6 Ptl):1908-13, 2001),并且涉及肺瘤誦 相关蛋白质诸如基质金属蛋白酶-2循环水平(Gohji等，Cancer Research 56:3196,1996)、肝细胞生长因子(Gohji等，J. Clin. Oncol. 18:2963, 2000)和组织多肽抗原(Maulard-Durdux等，J. Clin. Oncol. 15:3446, 1997)的研究已经显示其前景。这些生物标记物提供备选的诊断方法， 然而，它们并没有被广泛应用。此外，除了应用一些组织化学、遗 传学和免疫学的标记物，临床医生仍然难以预测肿瘤将转移至其它 器官。
癌症生物标记物的鉴定与改善疾病的诊断、预后和治疗尤 其相关。这样，本领域需要鉴定可快速、容易和安全地测定的备选 的生物标记物。这样的生物标记物可用于诊断、分阶段或监测膀胱 癌(尤其是侵袭性)患者，该疾病的潜在转移阶段患者的发展或治疗。发明简述
本发明基于以下惊奇的发现，即三种蛋白质，半胱氨酸蛋 白酶抑制剂B、伴侣蛋白lO和肌动蛋白抑制蛋白(Profilin)(也被称为 "上皮癌标记物")，存在于膀胱癌(一种上皮源性癌症)患者的尿中。 因此，本发明涉及用于上皮源性癌症的预后性评价的方法和涉及用 于通过监测生物样品中这些标记物的存在使上皮源性癌症的诊断更 容易的方法。本发明还涉及用于治疗学功效的标记物。特别是，尿 中测定的半胱氨酸蛋白酶抑制剤B的量与疾病状态相关，这样，半 胱氨酸蛋白酶抑制剂B水平可用于预测侵袭性膀胱癌的存在。因而， 检测尿中半胱氨酸蛋白酶抑制剂B、伴侣蛋白10和/或肌动蛋白抑制 蛋白的水平，提供可用于在患者中诊断和预后膀胱癌的快速、容易和安全的筛查。或者，这些标记物缺乏可提供患者没有患膀胱癌的 指示。
在一个实施方案中，提供易于在患者中诊断上皮源性癌症的方法。所述方法包括从患者获得生物样品，优选为净排尿(voided urine)样品和测定样品中存在或缺乏至少 一种上皮癌生物标记物(半胱 氨酸蛋白酶抑制剂B、伴侣蛋白IO或肌动蛋白抑制蛋白)，其中至少 一种上皮癌生物标记物的存在表示上皮源性癌症。
生物样品，例如，可从血液、组织(如肿瘤或乳腺)、血清、 粪便、尿、唾液、脑脊髓液、乳头抽吸液(nipple aspirates)和细胞溶解 产物上清液得到。 一种优选的生物样品是尿。
如在本文中所用的，"上皮源性癌症"指由上皮细胞引起 的癌症，包括，但不限于，乳腺癌、基底细胞癌、腺癌、胃肠癌、 唇癌、口腔癌、食道癌、小肠癌和胃癌、结肠癌、肝癌、膀胱癌、 胰腺癌、卯巢癌、宫颈癌、肺癌、乳腺癌以及皮肤癌，诸如鳞状细 胞癌和基底细胞癌、前列腺癌、肾细胞癌和其它已知的影响全身上 皮细"包的癌症。
在一个实施方案中，提供易于在患者中诊断膀胱癌的方 法。所述方法包括从患者获得生物样品，优选为净排尿样品和测定 尿样品中存在或缺乏至少一种上皮癌生物标记物(半胱氨酸蛋白酶抑 制剂B、伴侣蛋白IO或肌动蛋白抑制蛋白)，其中至少一种上皮癌生 物标记物的存在表示膀胱癌。
在另一个实施方案中，提供诊断上皮源性癌症的方法。 包括检测存在于来自患者的生物样品(测试样品)中的至少一种上皮癌 生物标记物的水平，并且将观测到的至少一种标记物(半胱氨酸蛋白 酶抑制剂B、伴侣蛋白IO或肌动蛋白抑制蛋白)水平与存在于同样类 型的对照样品中的标记物水平比较。与对照样品比较，测试样品中 的较高水平的标记物表示上皮源性癌症。
在一个优选的实施方案中，本发明方法用于癌症的早期 检测。例如，可由医师在体^r期间对患者进行筛查。
在一个实施方案中，提供诊断膀胱癌的方法。所述方法 包括检测存在于来自患者的生物样品(测试样品)中的至少一种上皮癌 生物标记物(半胱氨酸蛋白酶抑制剂B、伴侣蛋白IO或肌动蛋白抑制 蛋白)的水平，并且将观测到的至少 一种标记物水平与存在于同样类 型的对照样品中的标记物水平比较。与对照样品比较，测试样品中 的较高水平的标记物表示膀胱癌。
在一个实施方案中，提供在患者中诊断侵袭性膀胱癌方 法。所述方法包括检测存在于来自患者的生物样品(测试样品)中的半 胱氨酸蛋白酶抑制剂B上皮癌生物标记物的水平，并且将测试样品 中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂B水平与存在于非侵袭性癌症对照样品 中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂B水平比较。与对照样品中的半胱氨酸 蛋白酶抑制剂B水平比较，测试样品中的较高水平的半胱氨酸蛋白 酶抑制剂B表示侵袭性膀胱癌。
术语"对照样品"指得自相信没有患癌症的"正常"或 "健康"个体的生物样品(如血液、尿、肺瘤)。可采用本领域熟知的 方法选择对照品。 一旦对于对照人群的水平已经确立，可将得自测 试生物样品的阵列结果与已知的水平直接比较。
术语"非侵袭性对照样品"指得自患有非侵袭性形式的 癌症个体的生物样品。 一旦对于对照人群的水平已经确立，可将得 自测试生物样品的阵列结果与已知的水平直接比较。
术语"测试样品"指得自被用于测试上皮源性癌症患者 的生物样品。
本发明还预期评估存在于得自同一患者的多个测试样品 中的上皮癌生物标记物水平，在整个时间中的标记物的量不断增加 表示癌症肿瘤的侵袭性(如转移的可能)增强。这样，上皮癌生物标记 物水平作为疾病状态和阶段的预测信号。
本发明还预期评估上皮癌生物标记物以监测设计用于治 疗上皮源性癌症(如膀胱癌)患者的治疗方案的治疗功效。
在本发明的一个方面，通过使测试样品或其制备物与特 异性结合上皮癌生物标记物或其部分的基于抗体的结合部分接触， 检测存在于测试生物样品中的上皮癌生物标记物水平(如(半胱氨酸蛋 白酶抑制剂B、伴侣蛋白IO或肌动蛋白抑制蛋白)。
基于抗体的免疫分析为检测生物标记物水平的优选方 法。然而，对于本领域专业技术人员已知的任何方法均可用于评估 生物标记物水平。例如，可用包括SELDI质谱的质镨法评估生物标 记物水平。
在另外的实施方案中，本发明提供包括检测生物样品中 至少 一种上皮癌生物标记物的方法的试剂盒。所述试剂盒包括装生 物样品(如尿样品)的容器和至少一种特异性结合上皮癌生物标记物的 抗体
在一个实施方案中，提供的试剂盒包括特异性结合上皮 癌生物标记物的两个抗体。在一个实施方案中， 一种抗体固定在固 相上和一种抗体被可检测性地标记。试剂盒可包括抗-半胱氨酸蛋白 酶抑制剂B、抗-伴侣蛋白10和/或抗-肌动蛋白抑制蛋白抗体。
本发明的其它部分在下文^^开。图的简述
结合并构成本说明书部分的附图，对本发明实施方案进 行说明，与描述一起，对本发明的目标、优点和原理进行解释。


图1是显示上皮癌生物标记物发现途径的流程图。
图2显示侵袭性膀胱肺瘤组织和正常的膀胱组织的比对 二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D page)揭示许多可能的斑点。经质语仪 鉴定，环形斑点为半胱氨酸蛋白酶抑制剂B。 .
图3显示描述在净排尿样品中测定的半胱氨酸蛋白酶抑 制剂B的半定量蛋白质印迹分析的结果图。发明详述
本发明人已经发现，三种蛋白质，半胱氨酸蛋白酶抑制 剂B、伴侣蛋白IO和肌动蛋白抑制蛋白(在本文称为"上皮癌标记物") 存在于患有上皮源性癌症的患者尿中。存在于患者的尿样品中的半 胱氨酸蛋白酶抑制剂B的水平与膀胱癌，尤其是侵袭性膀胱癌的存 在相关联。
术语"侵入性"或"侵袭性"涉及癌症时，指肿瘤的突 破自己的边界向邻近组织扩散的倾向(Daraell, J. (1990), Molecular Cell Biology,第3版，W. H. Freeman, NY)。侵袭性癌症可与限制在器官 中的癌症(其中胂瘤被限制在特定的器官中)作对比。肿瘤的侵袭性特 性常常伴有蛋白水解酶，诸如胶原酶的出现，其使基质物质和基底 膜物质降解以使肿瘤能够突破包嚢的边界和突破肿瘤所在的特定的 组织的限制而扩张。侵袭性膀胱癌包括侵袭入固有肌层和/或固有层 (Lamina Propria)。
如在本文中所用的术语"转移"，指癌症从原发器官扩 散至患者的其它末梢部位的情况。肿瘤转移的过程是多阶段事件， 包括局部入侵和破坏细胞内基质，内渗到血管、淋巴或其它传输通 道，在循环中残存，在第二个部位溢出管腔并且在新的场所生长 (Fidler,等，Adv. Cancer Res. 28, 149-250 (1978), Liotta,等，Cancer Treatment Res. 40, 223-238 (1988), Nicolson, Biochim. Biophy. Acta 948, 175-224 (1988)和Zetter, N. Eng. J. Med. 322, 605-612 (1990》。增加的恶性细胞活动力与动物以及人肺瘤中的增强转移潜力相关 (Hosaka，等，Gann 69, 273-276 (1978)和Haemmerlin,等，Int. J. Cancer 27， 603-610 (1981))。
如在本文中所用的"生物样品"指得自患者的尿样品。 生物样品，例如，可从血液、组织(如肿瘤或乳腺)、血清、粪便、尿、 唾液、脑脊髓液、乳头抽吸液和细胞溶解产物的上清液得到。 一种 优选的生物样品是尿。
在优选的实施方案中，对生物样品处理以预防上皮癌生 物标记物降解。抑制或预防降解的方法包括，但不限于，用蛋白酶 处理样品，将样品冷冻或将样品放在冰上。优选地，在进行分析前， 经常性地将样品保持在预防标记物降解的条件下。
如在本文中所用的，"肿瘤样品"指肿瘤的小部分、片、 部分、节或分片，所述肿瘤例如，从患者，优选为患者处得到或切 下的肿瘤(如，从患者的组织切片或提取物)。
如在本文中所用的，半胱氨酸蛋白酶抑制剂B指Genebank (基因库)索取号NM—000100.2、 NP—OOOOW (Homos叩iens)的蛋白质。 该术语还包括种类的变异、同源物、等位基因形式、突变形式及其 等价物。
如在本文中所用的，伴侣蛋白10指Genebank (基因库)索 取号(蛋白质)AAA50953 (Homosapiens)的蛋白质。该术语还包括种类 的变异、同源物、等位基因形式、突变形式及其等价物。
如在本文中所用的，肌动蛋白抑制蛋白指Genebank (基 因库)索取号(蛋白质)A28622 (Homosapiens)的蛋白质。该术语还包括 种类的变异、同源物、等位基因形式、突变形式及其等价物。
本发明涉及易于在患者中诊断上皮源性癌症的方法。在 一个实施方案中，所述方法包4舌从患者获得生物样品和测定样品中 存在或缺乏至少一种上皮癌生物标记物(半胱氨酸蛋白酶抑制剂B、 伴侣蛋白10或肌动蛋白抑制蛋白)，其中至少一种标记物的存在为上 皮源性癌症的指示物(mdicative)。
在另一个实施方案中，所述方法涉及测定来自正检测癌 症的患者的测试样品中至少 一种上皮癌生物标记物(半胱氨酸蛋白酶抑制剂B、伴侣蛋白IO或肌动蛋白抑制蛋白)的水平，并且将观测到 的水平与对照样品，例如得自单个患者的样品或未患癌症的单个患 者的群体样品中发现的上皮癌生物标记物的水平进行比较。比在正 常对照组中观测到的水平高的至少 一种上皮癌生物标记物的水平， 表示上皮源性癌症的存在。生物标记物水平可以任意单位表示，例如以如从光密度计、照度计或Elisa读板机得到的单位表示。
如在本文中所用的，"与对照样品中的水平比较，测试 样品中的至少一种上皮癌生物标记物的较高水平"指至少一种生物 标记物的量大于存在于对照样品中相同生物标记物的量。术语"较 高水平"指在有统计学意义的或显著地高于对照样品中发现的水平。 "较高水平"可为例如为1.2倍至1.9倍高。优选地，"较高水平" 至少为2倍甚或3倍高。
术语"有统计学意义的"或"显著地"指有统计学意义 并且一般意指标记物浓度为正常的两个标准差(2SD)或更高。
为了比4交的目的，测试样品和对照样品为同样类型，即 得自相同的生物来源。对照样品也可为含在得自健康个体的生物样 品中正常发现的、相同浓度的上皮癌生物标记物的标准样品。
在本发明的一个方面，可进行第二诊断步骤。例如，如 果发现至少一种上皮癌生物标记物的水平表示癌症的存在，那么可 进行测定癌症的其它的方法以确定癌症的存在。可使用任何多种其 它的诊断步骤，诸如超声波、PET扫描、MPI或任何其它的成像技 术、活检、临床检查、乳管摄影(ductogram)或任何其它方法。
本发明还提供对怀1€患上上皮源性癌症的患者进行预后 性评价的方法。所述方法包括冲全测存在于来自患者的测试生物样品 中的至少一种上皮癌生物标记物(半胱氨酸蛋白酶抑制剂B、伴倡蛋 白IO或肌动蛋白抑制蛋白)的水平，并且将将观测到的水平与在健康 个体的生物样品(同样类型)中正常发现的至少一种上皮癌生物标记物 水平的范围进行比较。例如，高水平表示较大可能转移活性并且对应于差的预后，而较低水平表示肿瘤的较低的侵袭性并且对应于比 较好的预后。
再有，可通过跟踪个体患者中的至少一种上皮癌生物标 记物水平，评估疾病的发展。例如，可通过比4支整个时间内患者的 半胱氨酸蛋白酶抑制剂B、伴侣蛋白IO或肌动蛋白抑制蛋白表达水 平的变化，监测患者病情的变化。至少一种上皮癌生物标记物水平 的进行性增加表示胂瘤入侵和转移可能性增加。
本发明的预后的方法还用于确定癌症患者的适当的疗 程。所述疗程指用于患者的诊断癌症后或治疗癌症后所采取的治疗 措施。例如，确定癌症复发、扩散或患者生存的可能性，可帮助确 定是否应该采用更保守或更激进的治疗方法，或治疗药征(modalities) 是否应该组合。例如，当癌症4艮可能复发时，有利地是可在手术治 疗之前或之后，伴用化学疗法、放射疗法、免疫疗法、生物调节剂 疗法、基因疗法、疫苗等或调整患者在治疗期间的时间范围。
本发明的方法适宜^^断或预后任何上皮源性癌症，包括， 但不限于，乳腺癌、基底细胞癌、腺癌、胃肠癌、唇癌、口腔癌、 食道癌、小肠癌和胃癌、结肠癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌、卯巢癌、 宫颈癌、肺癌、乳腺癌以及皮^UI，诸如鳞状细胞癌和基底细胞癌、 前列腺癌、肾细胞癌和其它已知的影响全身上皮细胞的癌症。
在一种优选的实施方案，上皮源性癌症是膀胱癌。發浙i,一神J:乂蕃i浙赤记# ^;^乎
如在本文中描述的，可采用本领域专业技术人员已知的 任何方法，检测至少一种上皮癌生物标记物的水平。在本发明中， 通常优选使用抗体或抗体等价物测定生物样品中的至少一种上皮癌 生物标记物蛋白的水平。
在一个实施方案中，通过将生物样品与特异性结合到至 少一种上皮癌生物标记物或至少一种上皮癌生物标记物的片段的基 于抗体的结合部分接触，检测至少一种上皮癌生物标记物蛋白的水平。然后在检测上皮癌生物标记物水平时，测定抗体-上皮癌生物标记复合物的结构(Formation)。
术语"基于抗体的结合部分"或"抗体"包括免疫球蛋白 分子和免疫球蛋白分子的免疫活性决定簇，如，含特异性结合(与之 起免疫反应)至上皮癌生物标记物以测定如半胱氨酸蛋白酶抑制剂 B、伴侣蛋白IO或肌动蛋白抑制蛋白的抗原结合位点的分子。术语 "基于抗体的结合部分"意欲包括如，任何同工型(IgG、 IgA、 IgM、 IgE等)的全部抗体，以及包括其也特异性反应的上皮癌生物标记物 蛋白的片段。可采用常规技术使抗体成片段。因而，术语包括可选 择性地与某些蛋白质反应的抗体分子的蛋白水解-裂解或重组-制备部 分的片段。这样的蛋白水解和/或重组片段的非限制性实例包括Fab、 F(ab')2、 Fab'、 Fv、 dAbs和含被肽接头(peptide linker)连接的VL和VH 域的单链抗体(scFv)。 scFv's可通过共价或非共价连接以形成具有两 个或更多个结合位点的抗体。因而，"基于抗体的结合部分"包括 多克隆抗体、单克隆抗体或其它抗体和重组抗体的纯化制备物。术 语"基于抗体的结合部分，，还意欲包括人源化抗体、双特异抗体和 具有至少 一种源于抗体分子的抗原结合决定簇的嵌合分子。在优选 的实施方案中，可测定地标记所述基于抗体的结合部分。
如在本文中所用的"标记抗体"，包括由可测定的方法 标记的抗体，所述抗体包括， <旦不限于，酶标抗体、放射性物质标 记的抗体、荧光标记的抗体和化学发光物标记的抗体。也可用可测 定的标记物诸如c-Myc、 HA、 VSV-G、 HSV、 FLAG、 V5或HIS标 记抗体。
在采用检测至少一种上皮癌生物标记物的基于抗体的结 合部分的本发明的诊断和预后方法中，存在于生物样品中的至少一 种上皮癌生物标记物的水平与乂人可测定的标记的抗体发射的信号强 度相关。
在一个优选的实施方案中，通过使抗体与酶连接，使基 于抗体的结合部分可测定地标记。当所述酶暴露于其底物时，则依 次将与底物反应，以此方法产生可由例如分光光度法、焚光分光光 度法或可见光的方法测定的化学部分。可用于可测定的标记本发明 抗体的酶包括，但不限于，苹果酸脱氬酶、葡萄球菌核酸酶、S-V-类 固醇异构酶、酵母醇(yeast alcohol)脱氢酶、ot-甘油磷酸脱氢酶、磷酸 丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、门冬酰胺酶、葡萄糖 氧化酶、(3-半乳糖普酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氪酶、葡萄糖-VI-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。化学发光是另一个可用 于测定基于抗体的结合部分的方法。
也可使用多种其它克疫分析的任何一种进行检测。例如， 通过放射性标记抗体，可通过〗吏用放射免疫分析法测定抗体。采用 这样的方法，使用Y计数器或闪烁计数器或通过放射自显影可探测放 射性同位素。特别用于本发明目的的同位素为W、 1311、 35S、 14C, 并且优选为125I。
还可能用焚光化合物标记抗体。当焚光标记抗体暴露于 适当波长的光下，则可由于焚光性测定其存在。最常用的焚光标记 化合物为CYE染料、异硫氰酸荧光素、蓝光碱性蕊香红(rhoda皿ne)、 藻红蛋白(phycoerytherin)、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二曱醛(o-phthaldehyde)和焚光胺。
也可使用发射荧光的金属诸如^Eu或其它的镧系元素可 测定地标记抗体。使用这样的金属螯合基团如二乙烯三胺五乙酸 (DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)使这些金属可连接抗体。
也可通过将抗体与化学发光的化合物偶合可测定地标记 抗体。然后通过测定在化学反应期间产生的发光的存在，确定化学 发光-抗体的存在。特别有用的化学发光标记化合物的实例为鲁米诺、 荧光素、异鲁米诺(isoluminol)、 theromatic吖啶镜酯、咪唑、吖咬镜 盐和草酸酯。
如以上提及的，可用免疫分析诸如酶联免疫吸附分析 (ELISA)、放射免疫分析(RIA)、免疫放射分析(IRMA)、蛋白质印迹 或免疫组织化学，测定至少一种上皮癌生物标记物蛋白的水平，以 上每种方法在下文详述。免疫分析诸如ELISA或RIA,可为非常快 速的，通常是更优选的。也可使用抗体阵列或蛋白质芯片(protein chips),参见，例如美国专利申请号20030013208A1; 20020155493A1; 20030017515和美国专利号:6,329,209; 6,365,418,其全文通过引用 结合于本文。
"放射免疫分析"是采用抗原的标记(如放射性标记)的形 式测定和检测抗原、要探测的生物标记物浓度的技术。用于抗原的 放射性标记的实例包括311、 "C和1251。通过使生物样品中的抗原与 用于结合特异性结合抗原的抗体的标记的(如放射性)抗原竟争，检测 生物样品中的抗原浓度。为了确^床标记的抗原和未标记的抗原之间 的竟争性结合，标记的抗原以足够使抗体的结合位点饱和的浓度存 在。样品中抗原浓度越高，将结合抗体的标记抗原的浓度越低。
在放射免疫分析中，为了测定结合抗体的标记抗原的浓 度，必须将抗原-抗体复合物与游离抗原分开。将抗原-抗体复合物与 游离抗原分开的 一种方法是，用抗-同位型抗血清使抗原-抗体复合物 沉淀。将抗原-抗体复合物与游离抗原分开的另一种方法是，用福尔 马林杀死的金黄色葡萄球菌(S.做^M》使抗原-抗体复合物沉淀。将抗 原-抗体复合物与游离抗原分开的再一种方法是，进行"固相放射免 疫分析"，其中的抗体连接(如，共价连接)至琼脂糖珠(Sepharose beads)、聚苯乙烯孔、聚氯乙烯孔或微滴定孔。通过将结合至抗体的 标记的抗原浓度与基于含有已知浓度的抗原的样品所作的标准曲线 进行比较，可确定生物样品中的抗原浓度。
"免疫放射分析"(IRMA)是其中抗体试剂为放射标记的 免疫分析法。IRMA需要通过诸如结合至蛋白质如，兔血清白蛋白(RSA)技术，产生多价抗原缀合物。多价抗原结合物每个分子必须具 有至少2个抗原残基并且抗原残基必须间隔足够距离以允许至少两 个抗体结合于抗原。例如，在IRMA中多价抗原缀合物可连接至固 体表面诸如塑料球。将未标记"样品"抗原和结合至经放射标记的 抗原的抗体加至含多价抗原缀合物包被的球的试管中。样品中的抗 原与多价抗原缀合物竟争抗原抗体结合位点。经过适当的孵育期后， 通过洗涤将未结合的反应物除去，测定固相上放射活性的量。结合 的放射性抗体的量与样品中的抗原浓度成反比。
最常用的酶免疫分4斤是"酶if关免疫吸附分析(ELISA)"。 ELIS A是采用抗体的标记(如酶联)形式测定和检测抗原浓度的技术。 有不同形式的ELISA，其为本领域专业技术人员所熟悉。本领域已 ^口的ELISA才示准4支术在"Methods in Immunodiagnosis",第2 X反，Rose 和Bigazzi编著.John Wiley & Sons, 1980; Campbell等，"Methods and Immunology", W. A. Benjamin, Inc., 1964;和Oellerich， M. 1984, J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 22:895-904中有描述。
在"夹心ELISA"中，抗体(如抗-半胱氨酸蛋白酶抑制剂 B、抗-伴侣蛋白lO或抗-肌动蛋白抑制蛋白)连接至固相(即微滴定板) 上并且暴露于含抗原(如半胱氨酸蛋白酶抑制剂B、伴侣蛋白10和/ 或肌动蛋白抑制蛋白)的生物样品。然后洗涤固相除去未结合的抗原。 然后使标记抗体(如酶联)结合至结合的抗原(如果存在)上，形成抗体-抗原-抗体夹心模式。可连接至抗体的酶的实例为碱性磷酸酶、辣根 过氧化物酶、荧光素酶、脲酶和卩-半乳糖苷酶。酶联抗体与底物反 应，产生可检测的有颜色的反应产物。
在"竟争性ELISA"中，将抗体与含抗原(即至少一种上 皮癌生物标记物)的样品一起孵育。然后使抗原-抗体混合物与用抗原 (即，至少一种上皮癌生物标记物)包被的固相(如微滴定板)接触。存 在于样品中的抗原越多，将可用于结合固相的游离抗体越少。然后将标记的(如，酶联)笫二抗体加至固相以测定结合至固相的第 一抗体 的量。
在"免疫组织化学分析"中，通过将组织暴露于对被分 析的蛋白质为特异性的抗体，^H"组织切片进行特异性蛋白质的测试。 然后通过许多方法中的任何方法使抗体显现，以确定所存在的蛋白 质的存在和量。用于使抗体显现的方法实例，例如，通过酶联接抗 体(如，荧光素酶、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或f3-半乳糖苷酶)或 化学方法(如，DAB/底物chromagen)。还可预期的是，可将组织微阵列用于本发明的方法中。
依据执业医师基于本公开的偏爱，其它技术可用于测定 至少 一种上皮癌生物标记物。 一种这样的技术是蛋白质印迹(Towbin 等，Proc. Nat. Acad. Sci. 76:4350 (1979》,其中将适合的经处理的样 品过SDS-PAGE凝胶，然后转移至固体载体诸如硝化纤维素滤器上。 然后可测定的标记的抗-生物标记物抗体可用于评估至少一种上皮癌 生物标记物的水平，其中可测定的标记物的信号强度与存在的生物 标记物的量相当。例如可用光密度分析法对所述水平定量。
再有，可采用质谱法诸如MALDI/TOF(飞行时间)、 SELDI/TOF、液相色谱-质谱法(LC-MS)、气相色语-质谱法(GC-MS)、 高效液相色i脊-质谱(HPLC-MS)、毛细管电泳-质谱法、核磁共振光谱 法或串联质i普法(如，MS/MS、 MS/MS/MS、 ESI-MS/MS等)，测定 至少一种上皮癌生物标记物。参见，例如，美国专利申请号 20030199001、 20030134304、 20030077616，这些通过引用结合于本 文。
质i普方法为本领域所熟悉并且已经用于定量和/或鉴定生 物分子，诸如蛋白质(参见，如，Li邻OOO) Tibtech 18:151-160; Rowley 等(2000) Methods 20: 383-397;和Kuster和Mann (1998) Curr. Opin. Structural Biol. 8: 393-400)。此外，质i普技术已经发展为允许至少部分分离的蛋白质重新测序。Chait等，Science 262:89-92 (1993); Keough 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96:7131-6 (1999);在Bergman, EXS 88:133-44 (2000)的综述。
在某些实施方案中，使用气相离子分光光度计。在其它 实施方案中，使用激光解吸/电离质谱以分析样品。现代激光解吸/电 离质谱("LDI-MS")可实施两个主要变化基质辅助激光解吸/电离 ("MALDI")质谱和表面加强的激光解吸/电离("SELDr)。在MALDI 中，将被分析物与含基质的溶液混合并将一滴液体置于底物的表面。 然后将基质溶液与生物分子共结晶。将底物插入质谱仪。激光能量 直接施加在底物表面，在那儿生物分子被解吸和电离，而不使它们 明显片段化。然而，MALDI作为分析工具有局限性。它不提供可干 扰检测的使样品和基质物质，特别是低分子量被分析物分级分离的 方法。参见，如，美国专利号5,118,937 (Hillenkamp等)和美国专利 号5，045,694 (Beavis & Chait)。
在SELDI中，将底物表面修饰，以使其为解吸过程中的 活性参与者。在一个变化中，用选择性结合所涉及的蛋白质的吸附 剂和/或捕捉剂使表面衍化。在另一个变化中，用当激光穿击时不解 吸的能量吸收分子使表面衍化。在另一个变化中，用结合所涉及的 蛋白质和含应用激光会断裂的光解结合剂(photolytic bond)的分子使 表面衍化。在这些方法的每个方法中，衍化剂一般局限在施用样品 的底物表面上的特异性位置。参见，如，美国专利号5,719,060和WO 98/59361。此两个方法可通过例如，使用SELDI亲合力表面捕获被 分析物和加入含基质的液体以捕获被分析物合并，而提供能量吸收 物质。
有关质谱仪的更多信息，参见，如Principles of Instrumental Analysis,第3版,Skoog, Saunders College Publishing, Philadelphia, 1985; 和Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology,第4增 补版。第15巻(John Wiley & Sons, New York 1995),第1071-1094页。
探测标记物的存在将典型地包括探测信号强度。此依次 可反映结合于底物的多肽的量和特征。例如，在某些实施方案中， 可比较第一样品和第二样品的光谱峰值的信号强度(如，目测，通过 电脑分析等)，以确定具体生物分子的相对的量。软件程序诸如Biomarker Wizard程序(Ciphergen Biosystems， Inc., Fremont, Calif.)可用于帮助分析质谱。质谱仪及其技术为本领域专业技术人员熟悉。
本领域任何专业技术人员理解，可将质谱仪的任何组成 部分(如，解吸源、质谱分析器、探测等)和各种样品制品与本文或本 领域已知的那些其它适宜成分或制品组合。例如，在一些实施方案 中，对照样品可含重原子(如13C),从而在同一质谱测量中允许测试 样品与已知对照样品混合。
在一个优选的实施方案中，使用激光解吸飞行时间(TOF) 质谱仪。在激光解吸质谱中，将结合标记物的底物导入进样系统。 通过自电离源的激光使标记物解吸和电离为气相。产生的离子由离 子光学集合(系统)收集，然后在飞行时间质谱分析仪中，使离子通过 短的高压场加速并任其漂流进入高真空室。在高真空室的远端，力口 速的离子在不同时间撞击灵敏探测器表面。由于飞行时间是离子质 量的函数，离子形成和离子探测器撞击之间的消逝时间可用于确定 特异性质量与电荷比的分子的存在或缺乏。
在一些实施方案中，部分通过用可编程的数字计算机执 行算法，测定存在于第 一或第二样品中的一个或多个生物分子的相 对量。所述算法确定第一质i普和第二质谱中的至少一个峰值。然后 所述算法比较质谱的第 一质谱峰值的信号强度与第二质谱峰值的信 号强度。相对信号强度为存在于第一和第二样品中生物分子的量的 指示。当第二样品提供使存在于第 一样品中的生物分子的量更好的 量化时，可分析含已知量的生物分子的标准品。在某些实施方案中， 也可确定第 一和第二样品中的生物分子的特性。
在一个优选的实施方案中，通过MALDI-TOF质谱检测 至少一种上皮癌生物标记物水平。 絲
用于本发明的抗体可从商业来源得到。或者，抗体可由 抗上皮癌生物标记物多肽或一部分上皮癌生物标记物多肽而产生。
可采用产生抗体的标准方法，生产用于本发明的抗体。 例如，通过单克隆抗体生产(Campbell, A.M., Monoclonal Antibodies Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science出W反商，Amsterdam, the Netherlands (1984);St. Groth等，J. Immunology, (1990) 35: 1-21;和Kozbor等，Immunology Today (1983) 4:72)。抗体也可易于通过使用蛋白质的抗原部分，用本 领域熟悉的方法筛查抗体库，诸如噬菌体展示库(display library)得 到。例如，美国专利5,702,892 (U.S.A. Health & Human Services)和WO 01/18058 (Novopharm Biotech Inc.)公开用于生产抗体结合域片段的噬 菌体展示文库和选择方法。
本发明还涉及用于膀胱癌的检测和预后性评价以及用于 4!袭性膀胱癌的诊断的市售试剂盒。所述试剂盒可以本领域普通专 业技术人员熟悉的任何结构存在并且可用于实施本文描述的检测至 少一种上皮癌生物标记物的一种或多种方法。试剂盒在提供许多但 非所有进行检测生物样品中至少 一种上皮癌生物标记物的分析的重 要试剂方面有其便利性。再有，所述分析优选与包含在试剂盒中的 标准品或多重标准品诸如预定量的至少一种上皮癌生物标记物蛋白或核酸同时进行，这样试验的结果可定量或验证。
所述试剂盒包括探测选择性结合至少一种上皮癌生物标 记物蛋白的至少一种上皮癌生物标记物水平诸如抗体或抗体片段的 方法。诊断分析试剂盒优选以才示准的两个-抗体结合格式板配制，其 中一个的至少一种上皮癌生物标记物-特异性抗体捕获患者样品中的生物标记物，而另 一个ADAM-特异性抗体用于探测捕获至少一种上 皮癌生物标记物。例如，将捕获抗体固定在固相上，如分析板、分 析孔、硝化纤维素膜、磁珠(bead)、纤维素测试条(dipstick)或洗提柱 的组分上。第二抗体，即，检测抗体，典型地用可测定的标记物诸 如量热剂或放射性同位素标记。
在一个优选的实施方案中，试剂盒包括测定尿样品中的 至少一种上皮癌生物标记物水平的方法。在特定实施方案中，试剂 盒包括"纤维素测试条'，及固定在其上的特异性结合上皮癌生物标 记物蛋白的至少一种抗-上皮癌生物标记物抗体或片段。然后可使用， 例如可用量热剂或放射性同位素可测定地标记的第二抗体，测定特 异性结合的上皮癌生物标记物蛋白。
在其它实施方案中，分析试剂盒可采用(但不限于)以下技 术竟争性和非竟争性分析、；故射免疫分析(RIA)、生物发光和化学 发光分析、荧光分析、夹心分4斤、免疫辐射计分析、斑点印迹、包 括ELISA的酶联分析、微滴定板和免疫细胞化学。对于每一试剂盒， 其分析的范围、灵敏度、精密度、可靠性、特异性和重现性通过本 领域专业技术人员熟悉的方法确定。
以上描述的分析试剂盒还将提供使用说明书和装尿样品 的容器。
本发明还通过下列的实施例加以详细说明。
提供这些实施例是帮助对本发明的理解而不视为对本发 明的限制。实施例1净排尿、膀胱癌组织和用于移行细胞癌症中生物标记 物发现的细胞系的蛋白质组学分析导言
需要新的生物标记物以帮助诊断和处理上皮源性癌症。 尿可用作上皮癌生物标记物发现和分析的很好的介质。通过二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D PAGE)的蛋白质组学分析是一种分析人样本的 蛋白质组的有效工具。本发明人应用2DPAGE分析了净排尿、人膀 胱肿瘤和正常组织，以及作为用于生物标记物发现的方法的人源性 膀胱癌细胞系。 方法
根据IRB批准的方案，本发明人从采用活检的诊断性膀 胱镜检查之前的63个患者和22个无膀胱癌临床迹象和无恶性疾病 史的、年龄匹配的对照患者中收集净排尿样品。分离和定量尿总蛋 白质。将等量的个体患者的蛋白质汇成三组l.阶段Ta,高级；2.阶 段Ta,低级；3.正常对照组。每组包含8个患者。分析来自每组的总 数为40ng(每个患者5ng)的蛋白质并用2D PAGe进行比较。逾教
根据IRB批准的方案，自阶段T3 Nl M0移行细胞癌症患者膀胱切除术的样本中收集膀胱肿瘤组织和正常膀胱上皮 (urothelium)。立即将组织样本于液氮中冷冻，然后分离和定量总蛋 白质。分析来自每个胂瘤组和正常组的40ng的蛋白质并用2D PAGE进行比较。 勿應^
从两个前述细胞系中分离分级的蛋白质(Fractionated protein): 1.MGH-U1,培养自高级的膀胱移行细胞癌症和高致瘤性棵 小鼠；2.MGH-U4,培养自患严重非典型尿道上皮癌症患者和棵小鼠 非致瘤性(细胞)。对来自每一细^^手、的细胞质、核和膜蛋白质组分各 40 ng进行分析并用2D PAGE进行比较。
对于以上所有样本，分离独特的蛋白质斑点和用液相色 谱质谱仪-质谱仪(LCMS-MS)分析。潜果
通过2D PAGE的分析确定代表普通或正常尿蛋白组学的 3组尿样品在普通分子量(MW)和等电点(pI)的一些蛋白质斑点。同样 地，本发明人证明组织样本和细月包系的普通蛋白质组学光傳。来自Ta 高级患者的尿、胂瘤组织和MGH-U1细胞系的蛋白质组学光谱，在 MW10-15kD和pI8-10的范围中，显示几个相似的肽斑点，它们不 存在或已经鉴定这些蛋白质中的三种为半胱氨酸蛋白酶抑制剂B(内 源性半胱氨酸蛋白酶抑制剂)、伴侣蛋白IO(热休克蛋白)和肌动蛋白 抑制蛋白(细胞骨架蛋白)。潜论
本发明人证实发现了三种新的对上皮源性癌症的生物标记物。实施例II对于膀胱癌组织中半胱氨酸蛋白酶抑制剂B免疫染色 才法
将正常膀胱和膀胱癌组织使用小鼠单克隆抗-半胱氨酸蛋 白酶抑制剂B抗体进行免疫染色并且用苏木精复染(counterstained)。 使用膀胱癌组织微阵列BL801 (US Biomax Inc, Rockville, MD)进行免 疫染色。将组织脱蜡，于3%过氧化氢的曱醇溶液中内源性过氧化物 封闭，并且使用抗原解掩蔽溶液(Unmaskmg Solution)施行微波抗原修 复(retrieval)。使用5%常规马血清封闭和用抗生物素蛋白/生物素试剂 盒封闭内源性生物素。用小鼠单克隆抗-半胱氨酸蛋白酶抑制剂 B/Stefm B抗体、克隆A6/2 (GeneTex, Inc, San Antomo， TX),随后用 抗-小鼠生物素化的次级抗体孵育组织，使用ABC试剂盒扩增和用 DAB显色。用Gill's Hematoxylin #3 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)使 组织复染色和用Tacha's Bluing Solution (Biocare, Concord, CA)变蓝。 除非另外指明，所有试剂购自Vector Laboratories, Burlingame, CA。 所有影像在摄影时的曝光时间相同。錄^
来自膀胱癌患者的样本中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂B水 平显著高于正常膀胱组织样本中所观测到的水平。
权利要求
1.一种易于诊断上皮源性癌症患者的方法，该方法包括a.从患者获得生物样品；和b.检测生物样品中至少一种上皮癌生物标记物的存在或缺乏，其中至少一种上皮癌生物标记物的存在提示有上皮源性癌症，且其中上皮癌生物标记物选自半胱氨酸蛋白酶抑制剂B、伴侣蛋白10和肌动蛋白抑制蛋白。
2. —种用于在患者中诊断上皮源性癌症的方法，该方法包括a. 检测来自患者的生物样品，即测试样品中存在的至少一种上 皮癌生物标记物的水平；b. 将测试样品中的至少一种上皮癌生物标记物的水平与存在于 对照样品中的上皮癌生物标记物的水平进行比较；其中与对照样品中的上皮癌生物标记物的水平比较，测试样品 中的至少一种上皮癌生物标记物的较高水平提示有上皮源性癌症， 且其中上皮癌生物标记物选自半胱氨酸蛋白酶抑制剂B、伴侣蛋白10 和肌动蛋白抑制蛋白。
3. 权利要求1或2的方法，其中所述上皮源性癌症选自乳腺癌、 基底细胞癌、腺癌、胃肠癌、唇癌、口腔癌、食道癌、小肠癌、胃 癌、结肠癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、皮 肤癌、前列腺癌和肾细胞癌。
4. 一种易于诊断患者的膀胱癌的方法，该方法包括a. 从患者获得生物样品；和b. 检测生物样品中半胱氨酸蛋白酶抑制剂B的存在或缺乏， 其中半胱氨酸蛋白酶抑制剂B上皮癌生物标记物的存在表示有膀胱癌。
5. —种诊断患者的膀胱癌的方法，该方法包括a. 检测来自患者的生物样品，即测试样品中存在的半胱氨酸蛋 白酶抑制剂B的水平；b. 将测试样品中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂B的水平与存在于对 照样品中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂B上皮癌生物标记物的水平进行 比较；其中与对照样品中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂B的水平比较，测 试样品中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂B的较高水平提示有膀胱癌。
6. —种诊断患者的侵袭性膀胱癌的方法，该方法包括a. 检测来自患者的生物样品，即测试样品中存在的半胱氨酸蛋 白酶抑制剂B的水平；b. 将测试样品中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂B的水平与存在于非 侵袭性对照样品中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂B的水平进行比较；其中与非侵袭性对照样品中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂B的水平 比较，测试样品中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂B的较高水平提示有侵 袭性膀胱癌。
7. 任一项前述权利要求的方法，其中所述生物样品是尿。
8. 权利要求1或4的方法，其中至少一种上皮癌生物标记物或 半胱氨酸蛋白酶抑制剂B的存在或缺乏是采用基于抗体的结合部分 检测的，所述基于抗体的结合部分特异性地结合于至少一种上皮癌 生物标记物或半胱氨酸蛋白酶抑制剂B。
9. 权利要求2、 5或6中任一项的方法，其中至少一种上皮癌 生物标记物或半胱氨酸蛋白酶抑制剂B的水平通过检测至少一种上 皮癌生物标记物蛋白或半胱氨酸蛋白酶抑制剂B的蛋白质水平来检 测。
10. 权利要求9的方法，其中所述上皮癌生物标记物的蛋白质 水平或半胱氨酸蛋白酶抑制剂B的水平由包括以下步骤的方法检测:a. 使测试样品或其制备物与特异性地结合上皮癌生物标记物或 半胱氨酸蛋白酶抑制剂B的基于抗体的结合部分接触，形成抗体-上 皮癌生物标记物复合物；和b. 检测复合物的存在，从而测定存在的上皮癌生物标记物的水平。
11. 依据权利要求8或10的方法，其中所述基于抗体的结合部 分用可测定的标记物标记。
12. 依据权利要求ll的方法，其中所述标记物选自放射性标记 物、半抗原标记物、荧光标记物和酶标记物。
13. 依据权利要求8或10的方法，其中所述基于抗体的结合部 分是抗体。
14. 依据权利要求13的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
15. —种用于检测尿样品中的至少一种上皮癌生物标记物的试 剂盒，所述试剂盒包括容纳尿样品的容器和至少一种特异性结合上 皮癌生物标记物的抗体。
16. 权利要求15的试剂盒，其中所述试剂盒包括特异性结合于 至少 一种上皮癌生物标记物的两种抗体， 一种抗体固定在固相上和 一种抗体纟皮可4企测性地标记。
17. —种用于测定尿样品中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂B的试剂 盒，所述试剂盒包括容纳尿样品的容器和至少 一种特异性结合半胱 氨酸蛋白酶抑制剂B的抗体。
18. 权利要求17的试剂盒，其中所述试剂盒包括特异性结合于 半胱氨酸蛋白酶抑制剂B的两种抗体， 一种抗体固定在固相上和一 种抗体4皮可4企测性i也标^己。
19. 权利要求15或17的试剂盒，它还包括使用说明书。
全文摘要
本发明基于以下发现，即半胱氨酸蛋白酶抑制剂B、伴侣蛋白10和肌动蛋白抑制蛋白此三种蛋白质，存在于一种上皮源性癌症的膀胱癌病人的尿中。因此，本发明涉及用于上皮源性癌症的预后的评价方法和涉及通过监测生物样品中这些标记物的存在而使上皮源性癌症易于诊断的方法。本发明还涉及用于治疗功效的标记物。
文档编号C12Q1/70GK101268368SQ200680009872
公开日2008年9月17日 申请日期2006年1月30日 优先权日2005年1月28日
发明者A·S·费尔德曼, B·R·策特, S·W·麦杜加尔 申请人:儿童医疗中心有限公司;综合医院公司