专利名称：：对有价值化合物进行微生物生产的方法
技术领域：
：本发明涉及通过微生物培养来生产有价值化合物的领域，所述有价值化合物优选为蛋白质，或次级代谢产物或原样的生物质。
背景技术：
：为了生产有价值化合物的目的对微生物的培养可在下述条件下完成，其中，向培养物中补充能导致生长限制的量的至少一种营养物，特别是在培养过程的生产期。典型地，营养物限制导致对所培养的微生物而言氮、碳或二者的限制。一方面由于生产蛋白质和其它有价值化合物逐渐增长的工业重要性，另一方面由于消耗的每克糖或每摩尔氧形成的生物质的低产率，仍然需要获得经在微生物中生产蛋白质和其它有价值化合物的改进方法。本发明提供了经改进的方法，用于高效制造蛋白质和其它有价值化合物。附图概述图l:基于消耗的氧的生物质产率(YXO)，与比生长速率相对图2:基于消耗的糖的生物质产率(YXS)，与比生长速率相对图3:基于消耗的氧的植酸酶产率(Ypo)，任意单位，与比生长速率相对图4:基于消耗的糖的植酸酶产率(Yps)，任意单位，与比生长速率相对
发明内容在第一个方面，本发明提供了通过培养微生物生产有价值化合物的方法，所述方法包括在培养基中培养所述微生物，其中在整个培养周期中过量提供所有营养物，并且向培养物中补充合适数量的氧，以保持所述培养物处于氧限制的条件下。用于培养微生物的营养培养基的组成对本发明不是关键的，只要在整个培养周期中过量提供所有营养物即可。特征"过量提供"是指所有的营养物以足够的量提供，以避免在微生物生长中造成限制。在本文上下文中，营养物可以仅以批次提供(即仅供应进初始培养基)，或可在培养过程中额外给料进培养基中。优选地，提供给初始培养基后紧接着将一种或多种营养物给料进培养物中。更优选地，给料的营养物至少为碳源和/或氮源。显然，营养物不能以引起抑制效应或毒性效应的量提供。根据本发明，向培养物中给料合适量的氧，以维持培养物处于氧限制的条件下。"合适量的氧"在本文中被定义为能够在培养期间实现氧限制条件的、给料至培养物中的氧的量。在本发明上下文中，OTR(氧转移速率)是氧从气相转移至液相(培养基)的速率。OTR被表示为每单位时间的氧量(例如摩尔/小时)。可从进入发酵罐的氧的量和输出气体中测量到的氧的量之间的差异方便地确定OTR。通常，氧作为空气给料。然而也可以向培养基中给料纯氧和/或富含氧的空气和/或空气和氧分别给料。在本发明上下文中，OUR(氧吸收速率)为微生物消耗给料至培养基中的氧的速率。为了将培养基维持在根据本发明的氧限制下，给料至培养基中的氧的量不应超过被微生物消耗的氧数量。换言之，OTR应该与OUR基本相同。"基本相同"是指OTR与OUR相同，误差优选正或负10%，更优选地，5%。优选地，向培养物中给料合适量的氧以进一步确保OTR尽可能地高，即，如例如发酵罐构型和/或气体进料中氧浓度所允许地高，只要微生物能够立刻消耗氧。然而。技术人员知道也可以在低于可达到的最大OTR的OTR的氧限制下实施培养方法，例如为最大OTR值的80%或90%。当OTR与OUR基本相同时，典型地，培养基中的溶解氧浓度将是恒定的，并且如果氧限制控制培养，则溶解氧会是零或者接近零。确定根据本发明的培养方法中是否存在氧限制的优选方法是测定增加营养物给料对OTR的影响。如果营养物进料的增加不伴随OTR的增加，则存在氧限制。确定根据本发明的培养方法中是否存在氧限制的最优选方法是检测例如搅拌器速度的轻微降低(例如5%)对OTR的影响。如果OTR也降低，则存在氧限制。如果OTR不降低和/或仅溶解的氧浓度降低，则不存在氧限制。用来调节OTR的措施为技术人员公知。优选地，经调节的氧转移速率(OTR)条件可通过调节至少一种下述参数来完成，所述参数选自提高搅动、提高充气、提高超压、提高输入气流中的氧百分比(富集氧)、减少培养基重量、降低整体培养基粘度。为了调节整体培养基粘度，可采取涉及培养基成分、培养基稀释度、温度改变、营养物(例如根据WO03/029439的碳水化合物)的周期性脉冲间歇(cyclicpulse-pause)补料的措施。优选地，通过将培养基温度改变为比最佳生长发生的水平高或低2'C到6。C之间的水平来调节整体培养基粘度。更优选地，通过将培养基温度提高为比最佳生长发生的水平高2'C到6t:之间的水平来降低整体培养基粘度，特别是对于丝状真菌，如A^e一仏"m'^^。当然，需要时可进行相反措施以降低氧转移。在这种情况下，通过将培养基的温度降低为比最佳生长发生的水平低2'C到6'C之间的水平来提高整体培养基粘度。在本发明的一个实施方案中，通过有规律地测量OTR(如每1小时或每2小时)，以及根据测量的OTR与OUR设定点的对比来调节OTR(例如通过调节搅拌器速度)，将微生物培养基维持在氧限制下。OUR设定点将取决于被培养的微生物和培养情况，典型地，包括例如培养管类型、搅拌器配置、培养基类型和营养物给料条件。因此，用于具体培养方法的OUR设定点是根据经验通过确定OUR值来确立的，所述OUR值伴随尽可能高的OTR，只要被转移的氧立刻被微生物消耗。可在整个培养周期中将培养物维持在氧限制条件下。优选地，培养物在生产期期间被维持在氧限制的条件下。在这种情况下，在微生物足够生长后确立并维持氧限制的条件。技术人员明白生物质最小密度是氧限制发生的必要条件，即氧限制在足够的生长后确立。换言之，优选地，在培养过程的生产期，即生产有价值化合物的时期确立并维持氧限制的条件。典型地，微生物培养方法可分为涉及生物质形成的生长期和涉及有价值化合物产生的生产期。技术人员会了解培养的两个时期可以不严格地分开，而是在一定程度上重叠。另外，技术人员会了解在微生物培养的任何时期，都将在一定程度上产生有价值化合物。进行根据本发明的培养方法所必需的培养基对本发明来说并非关键的。根据所述生物的需要将营养物添加进方法中，只要营养物过量提供即可。在本发明上下文中，营养物不是氧。培养基方便地含有碳源、氮源以及微生物生长和/或有价值化合物形成所需要的额外化合物。例如，额外的化合物可能对于诱导有价值化合物的产生来说是必需的。本领域已知合适碳源的实例包括葡萄糖、麦芽糖、麦芽糖糊精、蔗糖、水解淀粉、淀粉、糖蜜、油。本领域已知氮源的实例包括大豆粉、玉米浆、酵母提取物、氨、铵盐、硝酸盐、尿素。额外化合物的实例包括磷酸盐、硫酸盐、微量元素和/或维生素。要添加进根据本发明的培养方法中的碳源和氮源总量可根据例如微生物的需要和/或培养过程的长度变化。培养方法中的碳源和氮源比例可显著变化，由此碳源和氮源间最佳比例的决定因素是要形成的产物的元素组成。微生物生长和/或产物形成所需的额外化合物(如磷酸盐、硫酸盐或微量元素)可以以在不同微生物种类间(即真菌、酵母和细菌间)变化的数量添加。另外，要添加的额外化合物的数量可通过形成的有价值化合物的类型来确定。典型地，微生物生长所需培养基成分的数量可根据培养中使用的碳源数量确定，因为所形成的生物质数量将基本上由所使用的碳源数量确定。根据本发明的培养方法优选以工业规模进行。工业规模方法应被理解为包括下述发酵体积规模的培养方法，所述体积规模>0.01m3，优选>0.1m3，优选〉0.5m3，优选>5m3，优选>10m3，更优选〉25m3，更优选〉50m3，更优选〉100m3，最优选〉200m3。生产有价值化合物或要作为生物质原样使用的任何微生物可用于根据本发明的培养方法，例如细菌、酵母和真菌生物。例如，适用于根据本发明培养的微生物菌株包括真菌菌株如Jc""wm'wm、^印erg/〃w、血ra96咖'(i^m、0，tococcMS、i^加(XWwm、FiwanY/m、//w附/co/a、Mag"opor^e、Mwcor、A(yce/—、7Veoca〃/mfl幼'x、7Vewrc^/wra、尸aecz'/ow少ces、尸/romycas、/Sc/n'zo//^〃ww、Jia/arc>m_yces、J^erwooscMS、7Tn'e/awa、7b/j^oc/a(i/w附禾口Jh'c/joderma菌株，酵母菌株如SaccAara附jcas、尸z'c/n'a、PA"j^2或A7t^yvera附少ces菌株禾口细菌菌株如5a"'〃M、^&cAenW^或v4c"wom少c"e菌株。特别地，丝状生物对氧限制在根据本发明培养方法的应用是有益的。丝状生物可以是丝状细菌如jcri朋mycetes，优选6Vr印tom少ces，或可以是丝状真菌。丝状真菌菌株包括但不仅限于Jcr继owZt/"7、J5perg〖〃t^、血reoZ)肌'c/ZMm、CV7/toc0ccMS、F/船(XS7Wwm、T^an'w/w、//wm/co/a、MagwopoWAe、Mwcor、Sc/n'zo//^〃w附、ra/araw少ces、J7zemjooscws、77'e/a"w'a、7b/_y/cc/afi^m禾口7Wc/iOife削a菌株。优选的丝状真菌细胞属于A^wp7/w或7Wc/w&rwfl属，更优选是o^^ae或7WcAoJew^禾中。最优选的y^/e^g〃/im'ger禾中为Js;9erg/〃1"m'gerCBS513.88及其衍生物。若干丝状真菌菌株可容易地由公众在大量培养物保藏所中获得，例如美国丰莫式培养物保藏所(ATCC)、DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH(DSM)、CentraalbureauVoorSchimmelcultures(CBS)和农业研究服务专利培养物保藏所(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection)，NorthernRegionalResearchCenter(NRRL)m'gerCBS513.88、As;erg/〃two^yzaeATCC20423、IFO4177、ATCC1011、ATCC9576、ATCC14488-14491、ATCC11601、ATCC12892、Jcremom'Mmc/，ogewwwATCC36225或ATCC48272、7h'cAoc/e環aATCC26921或ATCC56765或ATCC26921、sq/aeATCC11906、CAo^M/wr/wm/wcA72ovve;iseATCC44006及其衍生物。将要用于进行本发明的方法的微生物菌株可以是天然存在的微生物，或通过任何种类的诱变技术(例如经典诱变处理或遗传工程技术)从任何合适亲本菌株获得的微生物菌株。由用于进行本发明方法的微生物产生的有价值化合物优选为多肽，例如酶或药物蛋白质。然而，所述方法也适用于产生代谢物(例如类胡萝卜素或维生素)，或同样适用于产生生物质。有价值的化合物可以由单个基因或组成生物合成或代谢途径的一系列基因编码，或可以是单个基因产物或一系列基因产物的直接结果。有价值化合物对微生物来说可以是天然的或异源的。术语"异源化合物"在本文中被定义为对细胞并非天然的化合物；或其中进行了结构修饰以改变所述天然化合物的天然化合物。根据本发明产生的有价值化合物可以是多肽。多肽可以是具有目的生物活性的任何多肽。术语"多肽"在本文中不意指特定长度的被编码的产物，其因此包括肽、寡肽和蛋白质。术语"多肽"还包括结合形成被编码产物的两种或更多多肽。多肽还包括杂交多肽，其包含得自至少两种不同多肽的部分或完整多肽序列的组合，其中一种或多种对丝状真菌细胞来说可是异源的。多肽还包括上述多肽的天然等位变体和设计的变体和杂交多肽。多肽可以是胶原或明胶，或其变体或杂交体。多肽可以是抗体或其部分、抗原、凝固因子、酶、激素或激素变体、受体或其部分、调节蛋白质、结构蛋白质、报告子或转运蛋白、涉及分泌过程的蛋白质、涉及折叠过程的蛋白质、陪伴分子、肽氨基酸转运子、糖基化因子、转录因子、合成肽或寡肽、细胞内蛋白质。细胞内蛋白质可以是酶，例如蛋白酶、神经酰胺酶、环氧化物水解酶、氨基肽酶、酰基转移酶、醛縮酶、羟化酶、氨基肽酶、脂肪酶。多肽可以是细胞外分泌的酶。这类酶可属于氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、连接酶、过氧化氢酶、纤维素酶、甲壳酶、角质酶(cutinase)、脱氧核糖核酸酶、葡聚糖酶、酯酶。所述酶可以是糖酶如纤维素酶，例如内切葡聚糖酶、/3-葡聚糖酶、纤维二糖水解酶或/3-糖苷酶、半纤维素酶或果胶分解酶，例如木聚糖酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、半乳糖苷酶、果胶甲基酯酶、果胶裂合酶果胶酶、内切多聚半乳糖醛酸酶、外多聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、阿拉伯木聚糖水解酶、半乳糖醛酸酶、裂合酶或淀粉酶；水解酶，异构酶或连接酶，磷酸酶例如植酸酶，酯酶例如脂肪酶，蛋白水解酶，氧化还原酶例如氧化酶，转移酶或异构酶。所述酶可以是植酸酶。所述酶可以是氨基肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、内切蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、过氧化氢酶、甲壳酶、角质酶、环糊精葡萄糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶。a-半乳糖苷酶、糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、a-葡萄糖苷酶、e-葡萄糖苷酶、卤素过氧化物酶、蛋白水解酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变构酶(mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、多酚氧化酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、脱氨基酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶、单加氧酶。根据本发明产生的有价值化合物可以是多糖。所述多糖可以是任何多肽，其包括但不限于粘多糖(例如肝素和透明质酸)和含氮多糖(例如甲壳质)。在更优选的选择中，多肽为透明质酸。术语"代谢物"包括初级和次级代谢物；所述代谢物可以是任何代谢物。优选的代谢物为柠檬酸。代谢物可以由一个或多个基因(如生物合成或代谢途径中的多个基因)编码。初级代谢物是细胞初级代谢或一般代谢的产物，其涉及能量代谢、生长和结构。次级代谢物是次级代谢的产物(参阅例如R.B.Herbert,TheBiosynthesisofSecondaryMetabolites,ChapmanandHall,NewYork,1981)。根据本发明产生的初级代谢物可以是，但不仅限于氨基酸、脂肪酸、核苷、核苷酸、糖、三酰甘油或维生素。根据本发明产生的次级代谢物可以是，但不仅限于生物碱、香豆素、类黄酮、聚酮化合物、奎宁、甾族化合物、肽或萜。次级代谢物可以是抗伺育剂、吸引剂、杀菌剂、杀真菌剂、激素、杀虫剂或杀鼠剂。根据本发明的培养方法可作为分批(batch)、重复分批(repeatedbatch)、补料分批(fed-batch)、重复补料分批(repeatedfed-batch)或连续培养方法而进行。在分批方法中，在培养过程开始前将所有的培养基成分作为整体直接添加进培养基中。在重复分批方法中，进行培养基的部分收集和部分补充完全培养基，任选地重复若干次。在补料分批方法中，微生物生长和/或产物形成所必需的化合物的部分在培养方法开始之前提供于初始培养基中。在所述培养方法的进程中，可向所述方法中以一次补料或各化合物单独补料添加额外的碳源、氮源和/或其它化合物。在重复补料分批或持续培养方法中，在培养中额外添加完全的初始培养基。初始培养基可作为整体补料，或以例如碳源和氮源的独立的流补料。在重复分批补料方法中，以规律的时间间隔移出部分包含生物质的培养基，但是在连续方法中，部分培养基的移出持续进行。由此，用部分新鲜培养基对所述培养过程加以补充，确保培养基的体积和/或重量恒定。在本发明的一种优选实施方案中，应用分批补料或重复分批补料方法，其中向培养方法中添加碳源和/或氮源和/或其它化合物。在更优选的实施方案中，向培养方法中添加碳源和/或氮源。本发明的另一方面涉及对培养基下游加工的选择。根据本发明使用氧限制有助于下游加工，这特别是由于有价值化合物的高产量和副产品的低数量导致的。下游加工可包括回收以及配制步骤。优选地，通过本发明的氧限制方法获得的有价值化合物被从培养基中回收和/或配制于合适的组合物中。培养过程结束后，可使用开发来用于回收目的有价值化合物的标准技术，从培养基中回收有价值产物。从而，要使用的相关的下游加工技术取决于有价值化合物的性质和细胞定位，并取决于所期望的目的产物纯度水平。在一种典型的回收方法中，使用例如离心或过滤将生物质从培养液中分离。然后在有价值化合物积累在内部或与微生物细胞结合的情况下，从生物质中回收有价值化合物。当然，同样也可使用生物质。否则，当有价值产物从微生物细胞中分泌出时，将其从培养液中回收。生物质和/或有价值化合物可配制为而提或固体产物。优选地，从培养物中回收通过本发明方法获得的有价值化合物，并/或将其配制于合适的组合物中。通过以下实施例进一步说明本发明，所述实施例不应被解释为限制本发明的范围。实施例实施例1通过乂印erg"/MSm'ger工业制造植酸酶根据WO98/46772设计并构建过表达植酸酶的J^^^7/mm'gwCBS513.88。操作细胞库在-8(TC下储存于约1ml的小管中。接种程序向预培养培养基中添加一管内容物带挡板的2L摇瓶(20g/LComSteepSolid、20g/L葡萄糖，pH6.5(用NaOH调节)，300ml培养基，在12rC下蒸汽灭菌30分钟)。预培养物在34。C和220rpm下生长40小时。当然，可根据摇瓶结构和小管的存活力改变时间。连续培养培养基由葡萄糖和麦芽糖糊精以及盐级分的混合组成。盐级分与W098/37179中12页的表1匹配。对该表格的改变为MgS04.7aq0.25g/L、CaC12.2aq0.22g/L、(NH4)2S046g/L、拧檬酸.1aq0.2g/L(螯合剂)。用于分批和补料的培养基组成相同。用于碳限制或氧限制的葡萄糖浓度分别为22.5或45g/L，而麦芽糖糊精分别为2.5或5.0g/L。培养基以两种级分蒸汽灭菌，其中一种级分组合了糖和氯化钙。灭菌前培养基盐级分的pH为4.5(硫酸)，并在将所述级分并入发酵罐后控制(硫酸、氨)相同的pH。温度控制在34X:。用于碳限制或氧限制的空气流分别为1.0或0.5vvm(每分钟每培养基体积的空气体积)。生物反应器以6。％的接种体比例接种。操作体积为10L。对于碳受控的发酵，将DOT控制为接种前培养基DOT的20。X。术语"DOT"(溶解氧张力)被定义为溶解的氧的度量，并被表示为大气压下空气中饱和的溶解氧的百分比，即100%DOT为在大气压下可溶解的氧的最大量。DOT控制发酵一般用于碳受限制的发酵。对于氧受限制的发酵而言，将氧转移率控制(借助于搅拌速度)为相同稀释率时碳受限下测量值的80%,从而建立氧限制。以周期性的方式使用Clarol作为消泡剂最早的24小时为每30分钟2秒，然后稍后为每小时2秒。为了达到稳态，进行至少5倍体积的改变。对每种稳态进行一次新发酵。结果如从图1到图4可观察到(图中每个点都代表独立的稳态)，氧限制提供了与碳限制相比显著更高的以葡萄糖和氧为基础的生物质产率。更有趣的是，以葡萄糖和氧为基础的酶产率也被增强，尽管氧吸收速率更低。这清楚地展示了发酵在氧限制下进行时更高的生产力和更具成本效益的方法。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>权利要求1.通过培养微生物来生产有价值化合物的方法，所述方法包括在下述培养基中培养微生物，并向培养物中进料适量的氧，以将培养物维持在氧限制的条件下，所述培养基中所有营养物在整个培养周期中过量提供。2.如权利要求1所述的方法，其中向所述培养物中添加适量的氧，以保证OTR与OUR基本相同。3.如权利要求2所述的方法，其中向所述培养物中添加适量的氧，以进一步保证OTR尽可能的高。4.如权利要求2或3所述的方法，其中通过调节至少一种下述参数调节所述OTR，所述参数选自搅动、充气、超压、输入气流中氧百分比、培养基重量、整体培养基粘度。5.如权利要求4所述的方法，其中通过将所述培养基的温度改变为比最佳生长发生的水平高或低2到6。C之间的水平来调节所述整体培养基粘度。6.如权利要求5所述的方法，其中通过将所述培养基的温度提高为比最佳生长发生的水平高2到6i:之间的水平来降低所述整体培养基粘度。7.如权利要求5所述的方法，其中通过将所述培养基的温度降低为比最佳生长发生的水平低2到6r之间的水平来降低所述整体培养基粘度。8.如权利要求1到7中任一项所述的方法，其中在所述生产期间所述培养物被维持在氧限制的条件下。9.如权利要求1到8中任一项所述的方法，其中所述微生物为丝状微生物，优选丝状真菌。10.如权利要求1到9中任一项所述的方法，其中获得的所述有价值化合物被从所述培养基中回收和/或被配制于合适的组合物中。11.如权利要求1到10中任一项所述的方法，其中所述有价值化合物为代谢物。12.如权利要求1到10中任一项所述的方法，其中所述有价值化合物为多肽，优选为酶。全文摘要本发明涉及通过培养微生物生产有价值化合物的方法，所述方法包括在培养基中培养所述微生物，其中在整个培养周期中过量提供所有营养物，并且，其中向培养物中进料合适数量的氧，以保持所述培养物处于氧限制的条件下。文档编号C12P21/00GK101287839SQ200680009614公开日2008年10月15日申请日期2006年3月23日优先权日2005年3月24日发明者罗希尔·莫伊伦贝格,菲利普·塞利·佛朗克斯·戈丹申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司