吸水层 5上覆盖有其它颜色例如黄色保护膜8-2。
[0033] 用于对照印迹线的羊抗鼠免疫球蛋白G或兔抗鼠免疫球蛋白G，及用于检测印迹 线和金标抗体纤维层的抗番鸭细小病毒的多克隆抗体和单克隆抗体的制备方法如下：
[0034] (1)羊抗鼠免疫球蛋白G或兔抗鼠免疫球蛋白G的制备
[0035] 以饱和硫酸铵法提取小鼠血清中的免疫球蛋白G:取1份血清加2份pH为7. 2 的PBS液混匀，加等体积饱和硫酸铵液混匀，置4°C冰箱内2小时，在4°C、10000r/min离 心15min，弃上清液；以适量pH= 7. 2的PBS液溶解沉淀，加饱和硫酸铵液至其最终浓度 为33 %，置4°C冰箱内2小时，在4°C、10000r/min条件下离心15min，弃上清液，以少量pH =7. 2的PBS液溶解沉淀，置4°C冰箱内用pH= 7. 2的PBS液过夜透析，换液2-3次，在 4°C、10000r/min条件下离心15min，收集上清液，以紫外分光光度计测定其蛋白浓度。以 50yg~100yg(免疫球蛋白G) /kg体重经皮下或肌肉注射抗体阴性健康羊或家兔3-4次， 末次免疫20天后，静脉采血，以ELISA测定其血清抗体效价在1 : 2000以上，心脏采血或 颈动脉放血，收集其高免血清，以饱和硫酸铵法提取羊抗鼠或兔抗鼠免疫球蛋白G，其提取 方法与上述提取小鼠血清免疫球蛋白G相同，制备羊抗鼠免疫球蛋白G或兔抗鼠免疫球蛋 白G用于标记本实用新型试纸条的对照印迹线。
[0036] (2)抗番鸭细小病毒单克隆抗体的制备
[0037] 差速离心、蔗糖密度梯度离心对番鸭细小病毒细胞毒进行浓缩、纯化，甲醛灭活后 用福氏佐剂乳化制备免疫原。
[0038] 以50-100yg/只剂量的免疫原免疫Balb/c系小鼠三次，每次间隔15-30天；第 三次加强免疫后3-4天，将免疫小鼠眼球放血，拉颈致死，于75 %酒精浸泡5-10min，无菌 取其脾细胞；剪碎并经100目尼龙网过滤，用GNK洗液混悬脾细胞，1000r/min离心lOmin， 收集脾细胞；将1X108个的脾细胞与2X10 7-5X107个的NS0骨髓瘤细胞混合，再用GNK 洗液混悬后，l〇〇〇r/min离心lOmin弃上清，细胞沉淀于37°C的水浴中在lmin内缓缓加入 0.7-1.011^的？￡6-1500&118.51119.0)边加边摇，然后缓慢加入6疆洗液151111，以终止？￡6 的作用；37°C水浴5min，1000r/min离心lOmin弃上清，将细胞沉淀重悬于1640/HAT选择培 养基中，并加入96孔培养板（200yL/孔），置于37°C、5 %C02培养箱中培养7-10天后，以 5-10yg/mL的纯化MDPVVP2蛋白包被96孔酶标板，以酶联免疫吸附试验（ELISA)检测杂 交瘤的培养上清，挑取强阳性细胞克隆（〇D45CI> 0. 5)，连续三次的有限稀释法进行亚克隆， 最后筛选得到特异性抗MDPV的单克隆细胞。
[0039] 该杂交瘤细胞染色体数为92-98,其分泌的抗番鸭细小病毒的单克隆抗体特异地 与番鸭细小病毒反应，亲和力常数达1〇 9_1(1，轻链亚型为k或X，重链亚型为免疫球蛋白匕、 免疫球蛋白G2a、免疫球蛋白G2b、免疫球蛋白G3，用于制备金标单克隆抗体。
[0040] (3)抗番鸭细小病毒金标单克隆抗体和金标单克隆抗体纤维层的制备
[0041] 将筛选到的特异性抗番鸭细小病毒的单克隆细胞扩大培养，PBS洗后1000r/min 离心lOmin，收集细胞，以1X106-2X106个/只对经产母鼠进行腹腔注射，10-20天后采集 小鼠腹水，4000r/min离心lOmin后的上清即为所需的单克隆抗体腹水。
[0042] 以柠檬酸钠还原法制备金溶胶：在50-100mL沸腾的0. 01-0. 05%氯金酸水溶液中 加入2-4mL的0? 5-2%柠檬酸三钠溶液，反应后获得直径15nm左右的胶体金。以0?lmol/L 的1(20)3调胶体金pH值至8. 5-9. 5,以1 : 1000-1300的印迹线比将待印迹线的抗番鸭细小 病毒单克隆抗体腹水加入PH8. 5-9. 5的金溶胶中，印迹线lOmin后，加20wt%的PEG-10000 至PEG-10000终浓度达到0. 05 %，4°C下、1500-3000r/min离心20min，除去未结合的胶体金 颗粒，4 °C下、15000r/min离心1小时，弃上清液，获得初步纯化的金标抗体蛋白混合物后， 用丙烯葡聚糖S-400柱层析，分离纯化金标蛋白，获得胶体金印迹线的抗番鸭细小病毒单 克隆抗体。
[0043] 将1 : 100-1:500稀释的胶体金印迹线的上述单克隆抗体吸附于精制玻璃棉 (尼龙纤维或聚酯纤维）中，4°C下低温真空干燥，即制得抗番鸭细小病毒金标单克隆抗体 纤维层。
[0044] (4)抗番鸭细小病毒多克隆抗体的制备
[0045] 使用灭活的MDPV细胞毒，单独多次免疫接种抗体阴性健康羊或兔。末次免疫20 天后静脉采血，以ELISA测定其血清抗体效价在1 : 1024以上，心脏采血或颈动脉放血，收 集其高免血清，以饱和硫酸铵法提取血清中的免疫球蛋白G，方法与提取小鼠血清免疫球蛋 白G相同。
[0046] (5)所述试纸条的检测操作方法
[0047] a、检测样品液的制备：无菌取病鸭的全血，以抗凝剂生理盐水作1:10-1 : 50 倍稀释，离心分离血液淋巴细胞悬液，待测；若取病鸭的组织如脾、脑、肠等，则将其剪碎、研 磨，以生理盐水制成1 : 2-1 : 5倍的待检测样品悬液，置4°C室温澄清或离心；
[0048]b、检测操作：将该试纸条测试端插入待检测样品中，插入深度不超过样品标记线 9,约30秒后取出试纸条，水平放置约1-5分钟，同时观察结果。
[0049]c、结果判断：如果在试纸条的纤维素膜层上只显示出一条棕红色对照印迹线C， 表示测检结果呈阴性，说明在被检样品液中未检测出番鸭细小病毒；如果试纸条上的纤维 素膜层出现棕红色的对照印迹线C和检测印迹线T，表示检测结果呈阳性，即在待检样品中 检出番鸭细小病毒；如果纤维素膜层上没有任何棕红色印迹线显示，则表明试纸条已失效 或操作有误。
[0050] (6)上述试纸条的检测原理：
[0051] 当试纸条测试端即吸附纤维层插入待检测样品溶液后，待检溶液通过层析作用带 动待检病番鸭病毒及金标抗体纤维层中的金标抗体一起向纤维素膜层扩散，并最终渗入手 柄端的吸水层中，扩散过程中待检病毒可与该病毒相对应的金标单抗相结合，进而与纤维 素膜层上检测印迹线中的抗该病毒的多抗免疫球蛋白G结合，从而显示出棕红色的检测印 迹线T;而对照印迹线中的羊抗鼠免疫球蛋白G或兔抗鼠免疫球蛋白G则可与金标单抗结 合，形成棕红色对照印迹线C。如果待检样品液中没有MDPV，试纸条只显示出一条棕红色对 照印迹线C;如果纤维素膜层上没有任何棕红色印迹线显示，则表明试纸条已失效或操作 失误。
[0052]〈实施例2>
[0053] 本实施例中的快速检测番鸭细小病毒的试纸条的结构、制备方法与实施例1基本 相同，其中，由尼龙纤维制成的金标抗体纤维层3上附着以胶体金标记的抗番鸭细小病毒 多克隆抗体；在硝酸纤维制成的纤维素膜层4上设有以抗番鸭细小病毒单克隆抗体溶液喷 涂的检测印迹线T，以羊抗鼠免疫球蛋白G或兔抗鼠免疫球蛋白G溶液喷涂的对照印迹线 C。其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均与实施例1相同。
[0054]〈实施例3>
[0055] 本实施例中的快速检测番鸭细小病毒试纸条，其结构、制备方法与实施例1基本 相同，其中，由聚酯纤维制成的金标抗体纤维层3上附