专利名称：无标记的定靶药理学方法
无标记的定靶药理学方法要求在先提交的美国申请的权益本申请要求2010年3月19日提交的美国临时申请第61/315，653号的优先权，其内容通过引用纳入本文。相关申请的交叉参考2010 年 3 月 19 日提交的名为 METHODS FOR DETERMINING MOLECULARPHARMACOLOGY USING LABEL-FREE INTEGRATIVE PHARMACOLOGY (使用无标记的整合药理学测定分子药理学的方法)美国临时申请号61/315625通过引用全文纳入本文。 背景本发明涉及生物传感器，并且更特别涉及使用所述生物传感器来鉴定靶标和分子。本发明也涉及测定分子定祀(on-target)药理学和药物开发的方法。
发明内容
本公开提供无标记定靶药理学方案，和对分子进行系统生物学和系统药理学分析、以及药物开发的方法、组合物、制品和机器。本发明也提供联用多个试验模式与无标记细胞整合药理学方案以测定分子定靶药理学的方法。
图1A-1H显示本发明方法怎样使用无标记定靶药理学方案来测定P 2肾上腺素能受体激动剂沙丁胺醇的定靶药理学。所述定靶药理学方法使用试验模式组来生成无标记生物传感器输出信号方面的多个药物药理学描述。图IA显示静息A431细胞响应沙丁胺醇持续刺激的DMR信号。这是持续刺激试验。图IB显示没有(DMS0-普萘洛尔)和用沙丁胺醇预处理(沙丁胺醇-普萘洛尔)的静息A431细胞的普萘洛尔DMR信号。这是顺序刺激试验。图IC显示在没有沙丁胺醇(毛喉素)和有沙丁胺醇(毛喉素+沙丁胺醇)下静息A431细胞响应毛喉素的DMR信号。这是共刺激试验。图ID显示经肾上腺素预处理A431细胞的沙丁胺醇DMR信号。这是反向顺序刺激试验，其中用所述受体的内源性激动剂预刺激所述细胞。图IE显示没有TBB (DMSO-沙丁胺醇)和有TBB (TBB-沙丁胺醇)预处理的静息A431细胞的沙丁胺醇DMR信号。这是顺序刺激试验。图IF显示没有百日咳毒素(DMS0-沙丁胺醇)和有百日咳毒素(PTX-沙丁胺醇)预处理的A431细胞的沙丁胺醇DMR信号。此处百日咳毒素处理过夜来预调理所述细胞。图IG显示没有沙丁胺醇(DMS0-肾上腺素)和有沙丁胺醇(沙丁胺醇-肾上腺素)的静息A431细胞的肾上腺素DMR信号。这是经典顺序拮抗剂试验，其中所述细胞预先暴露于分子，然后用内源性P 2AR激动剂肾上腺素刺激。图IH显示A431细胞中对下述4个标记组的沙丁胺醇DMR调节指数2nM肾上腺素、IuM组胺、32nM表皮生长因子和IyM烟酸。图1A-1H所示的所有实验中，沙丁胺醇的浓度是10 U Mo图2显示根据包含所示定靶药理学方案的本发明方法，已知肾上腺素能受体药物分子聚类的热图。所述热图用一维相似性分析制成。对调节百分比计算而言，就每个标记诱导DMR信号使用一种或两种DMR事件。对其他试验而言，由5个时域(time domain)响应组成的同一数字矩阵用于描述分子反应。所述5个时域响应是刺激后3分钟、5分钟、9分钟、15分钟和50分钟的DMR信号的真实值。对所述P肾上腺素能药而言，显然次聚类大部分由具有几乎同一治疗适应症的药物分子组成。
具体实施例方式下面详细描述本发明的各种实施方式；若有附图，则参考附图描述。参考各种实施方式不限制本发明的范围，本发明范围仅受所附权利要求书的范围的限制。此外，在本说明书中列出的任何实施例都不意在构成限制，而仅是列出要求权利的本发明的许多可能实施方式中的一些。
无标记的生物传感器细胞试验通常使用无标记的生物传感器以检测细胞中响应刺激的细胞反应。所得的生物传感器信号通常是反映作用于细胞上的分子药理学复杂度的整合反应。传统地，无标记生物传感器细胞试验直接监控细胞在分子刺激后的动力学反应，得到作用于细胞上的分子初级概况。或者，无标记生物传感器细胞试验也能用于检查分子对细胞内标记诱导生物传感器信号的影响，得到细胞中分子相对标记引发通路的二级概况。所述标记是已知能引起细胞中可重复生物传感器信号的分子。所述标记常是受体的所述内源性激动剂或激活剂。所述试验能在靶标特异性、潜能和有效性、和作用模式(即激动作用、或拮抗作用、或反向激动作用)方面进行分子的药理学定性。在所述试验中，所述药理学特性通常通过分析特定无标记事件的幅度或动力学参数完成，例如正DMR(P DMR)或负 DMR(N DMR)(见美国专利申请号 20090093011. Fang, Y.等，Biosensors for liganddirected functional selectivity (用于配体定向功能选择性的生物传感器))。尽管所述试验能测定通过受体(如￠2肾上腺素能受体)作用的分子的配体定向功能选择性，所述试验经常有数个缺陷(1)有效的多个参数分析需要高质量试验数据，特别是无标记生物传感器概况的动力学拟合极有挑战性，因为对每个生物传感器事件缺乏了解，和/或对描述每个类型的生物传感器信号缺乏有意义的数学方程。(2)所述配体定向功能选择性决定的分辨率大部分受限，因为所述试验经常限定在早期信号事件，特别是在所得生物传感器输出信号中起主要作用的所述事件。也可用无标记整合药理学方法以鉴定分子(参见美国申请号12/623，693,Fang, Y.等，“Methods for Characterizing Molecules (鉴定分子的方法)”，2009 年 11 月 23 号提交；美国申请号 12/623，708,Fang, Y.等,“Methods of creating an index (创造指数的方法)”，2009年11月23号提交)。在所述无标记整合药理学方法中，采用无标签生物传感器通过直接监控候选药物分子对代表人生理学和人病理生理学的不同种类细胞组的作用，确定候选药物分子的系统细胞药理学，以及确定候选药物分子独立地或者与标记分子组一起调节各细胞应答刺激生物传感器信号的能力。分子对细胞的直接作用产生其初级概况，而分子对标记诱导的生物传感器信号的调节产生二级概况。两种概况通常都记录为实时动力学细胞应答。在标记组作用的多种细胞之间比较不存在分子时的初级概况和分子存在时的二级概况，获得分子针对这些标记的多组调节概况。例如，能结合全部或部分组的概况产生索引。例如，分子作用于细胞组的所有初级概况的组合产生分子生物传感器初级指数，其中分子对标记组作用于相应细胞上的调节概况的组合产生分子生物传感器调节指数，并且分子生物传感器初级指数和分子生物传感器调节指数的组合产生分子生物传感器指数。比较分子指数和药理学已知调节剂组既定指数，能确定分子干预的细胞受体或靶标或通路。所述无标记细胞整合药理学方案提供关于多向药理学和表型药理学的信息。然而，所述无标记细胞整合药理学就测定作用于 特定靶标的分子的定靶药理学而言，分辨率也有受限。公开了测定分子的定靶药理学的方法，包含步骤a)从试验模式组中收集生物传感器反应；b)分析所述生物传感器反应；和c)测定分子的定靶药理学，或单独或与本文公开的任何方法或步骤、制品或机器任意组合。还公开了某些方法，其中，所述生物传感器反应是无标记生物传感器反应，其中所述组由2-10个试验模式组成，其中所述试验模式选自持续激动刺激试验、拮抗试验、顺序刺激试验、反向顺序刺激试验、共刺激试验、调节试验和调节概况试验，其中所述试验模式选自持续激动刺激试验、顺序拮抗刺激试验、反向顺序刺激试验、有通路调节剂的共刺激和用于不同通路的标记组的调节，其中一种或多种所述试验收集预定时间域的数据，或单独或与本文公开的任何方法或步骤、制品或机器任意组合。还公开了某些方法，其中有3-20、3-15、3-10、3_7或3_5个时域响应，其中在刺激后0-3分钟、3-6分钟、6-10分钟、10-20分钟、20-50分钟和50-120分钟测定所述时域响应，其中所述时域响应覆盖细胞信号转导的不同波动，其中在刺激后3、5、9、15和50分钟测定所述时域响应，其中分析所述生物传感器反应包含数字描述DMR信号，或单独或与本文公开的任何方法或步骤、制品、组合物、或机器任意组合。还公开了某些方法，所述方法还包含将所述数字描述DMR信号排成数字矩阵，其中所述数字矩阵由运行聚类算法分析生成，其中所述聚类算法分析是一维或二维聚类算法分析，其中所述聚类算法是分级(Hierarchical )、K均值或MCL聚类算法,其中所述聚类算法是分级聚类算法，其中所述分析使用最大配对关联来关联各组，其中所述聚类算法对距离度量使用欧几里德距离，其中所述聚类视为热图，或单独或与本文公开的任何方法或步骤、制品、组合物或机器任意组合。还公开了重新定位测试分子的方法，包含步骤收集来自试验模式组的所述测试分子的生物传感器反应；分析所述测试分子的所述生物传感器反应；测定所述测试分子的所述定靶药理学；聚类作用于同一靶标的药物分子和现有药物分子来鉴定药物分子定靶药理学的最接近匹配；和重新定位所述测试分子以指示所述最接近匹配的药物分子。A.组合物、方法、制品、和机器制药和生物技术产业受到看似相反目标的挑战(I)达到更低的新药损耗率和(2)缩短新药进入市场的引入时间。药物开发要求从近乎无限量的化学实体中选出具有所需药理和生理品质的隐蔽分子。不幸的是，药物的选择可以是成本极高且本质上低效的过程。尽管在先进技术上有大量投入，近年来新药批准的数量仍很低。目前的研发生产力的缺口 -医药研发花费相对于每年引入的候选新药数量的增加-已经引起广泛关注，对于该问题及其可能的解决方法有一些不同意见。基因组和蛋白质组的最新发展显著增加了新药的潜在靶标数量，这加剧了上述情况。尽管此前针对已知靶标有过成功，但靶标取向的药物开发技术往往不能针对新的靶标(即不是以前药物靶标的靶标)递送药物。重要的是，过去十年中全行业平均每年只有两到三个针对这些“创新型”靶标的小分子药物。因此，很多公司重新检查用于药物开发和发展的工具、技术和操作。这种反省突出了对基于系统生物学和系统药理学的药物作用的评估和验证的需求，和对更多生理相关技术的需求，特别是在药物开发中。I.无标记生物传感器a)生物传感器和生物传感器试验基于无标记细胞的试验常使用生物传感器监控活细胞中分子诱导的应答。分子可以是天然产生或是合成的，可以是纯化的或未纯化的混合物。生物传感器常利用传感器，例如光、电、热量、声、磁、或类似传感器将与生物传感器接触的细胞内的分子识别事件或分子诱发的变化转化成可定量的信号。这些无标记生物传感器可用于涉及鉴定分子复合物如何随时间形成和解离的分子相互作用分析，或用于涉及鉴定细胞如何响应刺激的细胞应答分析。可用于本方法的生物传感器包括例如，光学生物传感器系统如表面等离振子共振(SPR)和共振波导光栅(RWG)生物传感器、共振镜、椭圆计，和电生物传感器系统如生物阻抗系统。光子晶体生物传感器是RWG生物传感器。·(I) SPR生物传感器和系统SPR依靠棱镜把覆盖入射角范围的楔形偏振光导入装有导电金属膜(例如金)的平面玻璃基材上以激发表面等离子体。所产生的渐消波与金层中的游离电子云相互作用并被吸收，产生电荷密度波(即表面等离子体)并导致反射光强度的减弱。产生最小强度的共振角随传感器表面的反面上接近金层溶液的折射率而变化。(2) RffG生物传感器和系统RffG生物传感器可包括，例如基材(例如玻璃)、包埋了光栅或周期性结构的波导薄膜、和细胞层。RWG生物传感器利用通过衍射光栅的方式将光共振偶联进入波导，导致在溶液-表面界面的全内反射，进而在界面产生电磁场。这一电磁场本质是渐消的，表示它从传感器表面指数式衰减；它衰减到初始值的1/e的距离称为贯穿深度，它随具体的RWG生物传感器的设计而变化，但通常在约200纳米级。这类生物传感器利用这种渐消波鉴定传感器表面上或靠近该表面的细胞层由配体诱导的变化。RWG仪器可以根据角位移或波长移位测量细分为不同系统。在波长移位测量中，采用具有恒定角度的覆盖入射波长范围的偏振光照射波导，特定波长的光被偶联进入并沿波导传播。或者，在角位移仪器中，用单色光照射传感器并测量光的共振偶联角度。共振条件受与生物传感器表面直接接触的细胞层影响(例如细胞融合、粘附和状态)。当配体或分析物与活细胞内的细胞靶标(例如，GPCR、激酶)相互作用时，细胞层内局部折射率的任何变化可以通过共振角(或波长)的变化检测出。所述CorningK Fpic!系统采用RWG生物传感器进行无标记生化或基于细胞的试验(纽约州康宁的康宁公司(Corning Inc. ))□所述Epic 系统由RWG读板仪和SBS(生物分子筛选学会)标准微量滴定板组成。读板仪的检测器系统利用集成光纤测量细胞内配体诱导变化所引起的入射光波长移位。一系列照射-检测头以线性方式排列，从而能从384孔微孔板的列中各孔同时采集反射光谱。扫描整块板使得每个传感器被多次访问，每列被依序访问。采集入射光的波长并用于分析。所述仪器可包括温控单元以尽可能减少因温度波动导致的入射波长伪变化。测得的应答代表细胞群的平均应答。系统的不同部分例如样品加载可以自动化，也可以多通路化，例如用96孔或384孔微量滴定板。可以用机载的液体处理器或外接的液体处理附件进行液体操作。具体地，在各孔底部培养了细胞的细胞试验板的孔内直接添加或吸入分子溶液。细胞试验板包含一定体积试验缓冲液覆盖细胞。在分子添加步骤中还可以加入通过上下抽吸数次完成的简单混合步骤。(3)电生物传感器和系统电生物传感器由基底(例如，塑料)、电极、和细胞层组成。在这种电检测方法中,在排列于基底上的小金电极上培养细胞，并按时跟踪系统的电阻抗。阻抗是对细胞层电导率变化的测量。通常，在电极或电极阵列上施加固定频率或变频的微小恒定电压，随时间监控通过电路的电流。配体诱导的电流变化提供了细胞应答的测量。用于全细胞感测的阻抗测量最初于1984年实现。从那时起，基于阻抗的测量被应用于研究广泛的细胞事件，包括细胞粘着和扩散、细胞微动、细胞形态变化、和细胞死亡。经典阻抗系统的缺陷在于因使用小检测电极和大参照电极导致的高试验变化。为克服这一变化，最新一代的系统例如CellKey系统(美迪希实验仪器公司(MDS Sciex)，加利福尼亚州南旧金山)和RT-CES (艾森生物科 学公司(ACEA Biosciences Inc.),加利福尼亚州圣地亚哥)采用具有微电极阵列的集成电路。(4)高空间分辨率生物传感器成像系统光生物传感器成像系统包括SPR成像系统、椭圆计成像系统、和RWG成像系统，提供了高空间分辨率，可用于本公开的实施方式中。例如，SPR imager Il (GWC技术公司)采用棱镜偶联spr，在固定的入射角进行SPR测量，并用CCD相机采集反射光。记录表面的变化作为反射率变化。因此，SPR成像同时采集阵列中所有元件的测量。基于RWG生物传感器的扫频波长光解调系统可用于以成像为基础的应用。该系统中，采用快速可调激光源照射传感器或微孔板形式的RWG生物传感器阵列。可以通过检测激光波长扫描时传感器上反射的光功率随时间的变化来构建传感器光谱，用计算机化共振波长解调模型分析所测数据得到固定有受体或细胞层的生物传感器的空间解析图像。使用图像传感器自然生成基于成像的解调方案。可以无需移动部件获得二维无标签图像。或者，可以米用具有横向磁力或p_偏振光TM。模式的角度解调系统。该系统由发射系统和接收系统组成，发射系统产生光束阵列使其中每个以约200 u mx3000 y m或200 u mx2000 u m的维度照射RWG传感器，基于CXD相机的接收系统用于记录从这些传感器反射光束的角度变化。通过分光器和衍射光学镜片的组合获得排列的光束。该系统能每3秒对最多49个传感器(在7x7孔传感器阵列中)同时取样，或每10秒对最多整个384孔微孔板进行同时取样。或者，还可使用扫描波长解调系统。该系统中，采用覆盖恒定角度入射波长范围的偏振光照射并扫描整个波导光栅生物传感器，可同时记录各位置的反射光。通过扫描，也可以获得整个生物传感器的高分辨率图像。b)生物传感器参数无标签生物传感器如RWG生物传感器或生物阻抗生物传感器能实时跟踪配体诱导的细胞应答。非侵入性和无操作的生物传感器细胞试验不要求对细胞信号转导的现有知识。所得生物传感器信号包含涉及受体信号转导和配体药理学的重要信息。可以从细胞受刺激后的动力学生物传感器应答中提取多种参数。这些参数包括但不限于，总体动态、阶段、信号幅度、和动力学参数，包括从一个阶段到另一阶段的过渡时间和各阶段的动力学(参见 Fang, Y.和 Ferrie, A. M. (2008) “label-free optical biosensor forligand-directed functional selectivity acting on ￠2 adrenoceptor in livingcells (用于活细胞内作用于￠2肾上腺素受体的配体导向功能选择性的无标签光生物传感器)，，，FEBS Lett. 582, 558564 ；Fang, Y.等，(2005) “Characteristics of dynamic massredistribution of EGF receptor signaling in living cells measured with labelfree optical biosensors (用无标签光生物传感器测得的活细胞内EGF受体信号转导的动态质量再分布的特征)” Anal. Chem.，77，5720-5725 ；Fang, Y.等，(2006) “Resonantwaveguide grating biosensor for living cell sensing (用于活细胞感测的共振波导光栅生物传感器)” Biophys. J.，91，1925-1940)。对聚类或相似性分析而言，每个节点(即分子)的所述边缘属性(即生物传感器细胞反应数据)能不同。例如，对于细胞中的分子概况(初级次级)，边缘属性能是特定动力学参数(即DMR信号中的DMR事件的幅度或动力学)，或在刺激后给定时间的生物传感器信号 的真实值，或刺激后多个或所有时间点的生物传感器信号的真实值。就分子生物传感器次级概况而言，边缘属性也能是在对各标记初级概况标准化后，相对特定标记的生物传感器信号输出参数的调节百分比。因此，所述集体边缘属性代表显示节点分子的无标记药理学的有效方法，从而能根据本公开方法比较和测定与已知分子的分子相似性。c) DMR 参数(I)生物传感器输出参数本文讨论了多种不同的生物传感器输出参数。例如，确定刺激诱导的细胞内定向质量再分布动力学的六个参数可以是总体动态(即形状)、应答的阶段(在A431静息细胞内EGF所诱导DMR信号的具体实施例中，涉及细胞应答有三个主要阶段正动态质量再分布(P-DMR)、负动态质量再分布(N-DMR)、和恢复性正动态质量再分布(RP-DMR))、动力学、各阶段总持续时间、各DMR事件的总幅度、和从P-到N-DMR阶段或从N-DMR到RP-DMR阶段的转变时间。动态质量再分布常称为动态细胞物质再分布或定向质量再分布。可以从共振峰获得其它生物传感器输出参数。例如，可以采用峰位置、强度、峰形和半峰宽(PWHM)。还可以从生物传感器的共振带图像获得生物传感器输出参数。五种附加特征带形、位置、强度、分布和宽度。对于采用本文所公开生物传感器的任何细胞试验的给定应用，所有这些参数可独立使用或一起使用。使用参数的任何子集或组合可就给定试验或具体试验的给定变化产生特征，例如用于细胞受体试验的特征，和进一步用于基于EGF受体试验的特定特征。(a)涉及刺激诱导的定向质量再分布动力学的参数有多种生物传感器输出参数涉及刺激诱导DMR的动力学。这些参数考察当出现细胞的刺激事件时生物传感器数据输出发生的变化速率。刺激事件是能改变细胞状态的任何事件，举例来说，如向培养基中添加分子、从培养基中除去分子、改变温度或改变pH、或对细胞引入辐射。刺激事件能引起刺激效果，这可以是由刺激事件对细胞产生的任何效果，例如定向质量再分布。刺激事件可以是分子、化学物质、生化物质、生物物质、聚合物。所述生化物质或生物物质可以是肽、合成肽、或天然产生的肽。例如，很多不同的肽作为信号分子，包括促炎肽缓激肽、蛋白酶凝血酶、和血压调节肽血管紧张素。尽管这三种蛋白质的序列和生理学不同，通过不同细胞表面受体发挥作用，它们共用一类称为G蛋白偶联受体(GPCR)的细胞表面受体。GPCR的其它多肽配体包括加压素、催产素、促生长素抑制素、神经肽Y、GnRH、促黄体生成激素、促卵泡激素、甲状旁腺激素、食欲素、硬骨鱼紧张肽II、内啡肽、脑啡肽等。GPCR属于广泛且不同的基因家族，不仅应答肽配体，还应答小分子神经递质(乙酰胆碱、多巴胺、5-羟色胺和肾上腺素)、光、增味剂、味道、脂质、核苷酸和离子。GPCR使用的主要信号转导机制是和G蛋白GTP酶蛋白相互作用，其与包括胞内钙释放和cAMP生成在内的下游第二信使系统偶联。肽GPCR使用的胞内信号转导系统和所有GPCR所使用的相似，常根据与其相互作用的G蛋白和被激活的第二信使系统进行分类。对Gs偶联的GPCR，由受体激活的G蛋白Gs刺激下游活化腺苷酸环化酶和生成环AMP，而Gi偶联的受体抑制cAMP的生成。cAMP生成的一个关键结果是蛋白激酶A的激活。Gq偶联受体刺激磷脂酶C，释放IP3和二酰甘油。在ER内IP3与受体结合导致胞内钙的释放，随后激活蛋白激酶C、钙调蛋白依赖性通路。除了这些GPCR、GPCR的第二信使信号转导系统以外，GPCR通路显示与其它信号转导通路(包括酪氨酸激酶生长因子受体和MAP激酶通路)的串扰。受体酪氨酸激酶如EGF受体或黏着斑复合物的反式激活可通过衔接蛋白She、Grb2和Sos,以及下游Map激酶激活Erkl和Erk2来刺激ras激活。Src激酶还能在GPCR激活ras和map激酶通路中起到关键的中介作用。 可能发生一些刺激事件但数据输出没有改变。这种情况仍是刺激事件，因为细胞的条件在某些方面已经改变，这可能导致细胞或细胞培养中的定向质量再分布或变化。应当理解对本文公开的任何试验或任何细胞条件都能确定具体的特征。本文对很多不同试验公开了大量“特征”，但对于本文进行的任何试验，该试验的“特征”可以确定。对于任何给定试验可能有多于一个“特征”并且其中每个都能如本文所述确定。在采集生物传感器输出数据并考察一个或多个参数后，可以得到给定试验的特征。需要进行多次实验以鉴定最优特征，并且需要在不同条件下进行实验以找出最优特征，不过这能够完成。应当理解，本文公开的任何方法可含有步骤用于例如“识别”或“确定”或“提供”添附在该方法上的特征。(i)总体动态数据输出的总体动态是可供考察的一个参数。该总体动态参数观察数据集合的完整动力学情况。总体动态可供观察的一个方面是数据输出所产生曲线形状随时间的形状变化。因此，由数据输出产生的曲线形状在发生刺激事件时或者发生改变或者保持不变。改变的方向表明总体质量分布；例如正DMR (P-DMR)阶段表明在传感器的渐消尾部内的质量增加；净零的DMR提示在传感器渐消尾部内几乎没有净质量变化；而负DMR表明在传感器渐消尾部内的净质量减少。采用光生物传感器所得刺激诱导细胞应答的总体动态可以由单个阶段(P-DMR或N-DMR或净零DMR)、或两个阶段(例如，所述两个阶段可以是这三种阶段的任意组合)、或三个阶段或多个阶段(例如，在时程中可以出现超过一个P-DMR阶段)组成。(ii)应答的阶段可作为时间函数观察的另一参数是在数据输出中发生的阶段变化。无标签生物传感器产生数据输出，可供作图生成曲线。该曲线具有转变点，例如数据从增加状态变为减少状态或相反。这些变化可称为阶段转变，举例来说，它们发生的时间和它们采取的形状可用作生物传感器输出参数。例如，可以有P-DMR、净零DMR、N-DMR、或RP-DMR。所述P-DMR、N-DMR和RP-DMR的幅度能作为单独生物传感器输出参数测量。(iii)动力学另一生物传感器输出参数可以是数据输出任何方面的动力学。例如，完成阶段转变的速度。例如，阶段转变多快完成或完成数据输出耗时多长。另一可测量的动力学例子是数据输出整个阶段占用的时间长度。另一例子是P-和N-DMR阶段之一或两者的总持续时间。另一例子是P-和N-DMR阶段之一或两者达到总幅度的速度或时间。另一例子可以是从P-到N-DMR阶段的转变时间T0还可以测量P-DMR和N-DMR事件或阶段的动力学。(b)涉及共振峰的参数给定导模的共振峰是通过考察例如光强度与光偶联入生物传感器的角度，或光强度与进入生物传感器的偶联光波长而产生的一种数据输出。光波导光模光谱是通过采用大角度范围的光照射生物传感器的方式考察光强度与偶联光进入生物传感器的角度并监测 入偶联强度随角度的变化而产生的一种数据输出。在该光谱中，多个导模的多个共振峰共同出现。由于共振峰和OWLS光谱的原理相同，当发生特定波长的光或当光的产生使其以特定角度射到生物传感器上时，可以在生物传感器中互换采用给定导模的共振峰或多个导模的OWLS光谱，光源发射的光与生物传感器偶联并且这种偶联增强了生物传感器产生的信号。这种随偶联光的角度或波长变化的强度改变称为共振峰。传感器不同的给定模会产生具有不同特征的相似共振峰。有许多不同参数定义给定模式的共振峰或共振光谱，可与该峰相关使用以评价DMR或细胞效应。下面讨论其中的子集。⑴峰位置当用数据输出作图时，共振峰出现在例如光偶联进入生物传感器的特定波长或特定入射角。该峰发生的角度或波长位置会在刺激事件的应答中由于质量再分布或细胞事件而改变。例如，存在特定受体如EGF受体的潜在生长因子时，培养细胞的共振峰的位置会提高或降低偶联角度或偶联波长，这会造成共振峰中心位置改变。应当理解峰强度位置处可以测得，这也是一个良好的测量点，还可以测量共振峰上任意点的位置，例如，75%峰强度或50%峰强度或25%峰强度或66%峰强度或45%峰强度(认为公开了 1_100%峰强度的所有水平)。但是，当使用峰强度以外的点时，总会有某一个峰强度之前的位置和峰强度之后的位置都在，例如45%峰强度。因此，对任何峰强度以外的强度，在峰内总是有两个位置产生所述强度。这些非峰强度的位置可用作生物传感器输出参数，但需要简单知道所述强度的位置是在峰强度之前或峰强度之后。(ii)强度正如共振峰特定强度的位置可用作生物传感器输出参数，强度本身的量也可以是生物传感器输出参数。一种特定相关强度是给定模式的共振峰的最大强度。和位置相似，所述最大强度的量级会根据对细胞或细胞培养有特定影响的刺激事件的存在而改变，这种改变可以测得并用作特征。正如共振峰的位置，也可在峰内的任何强度或位置测得共振峰强度。例如，可以采用最大强度的50%或最大强度的30%或最大强度的70%或最大强度的1%和100%之间任意百分数作为生物传感器输出参数。同样，和强度的位置相似，若采用最大强度以外的强度，例如最大强度的45%，在共振峰内总会有两个位置具有该强度。正如强度位置参数，可以采用非最大强度，只是必须考虑所述强度是最大值前的强度或是最大值后的强度。例如，当初始的细胞融合约为50% (约50%融合时，传感器表面的细胞往往产生最大的PWHM值)时，抑制剂和激活剂的同时存在导致培养后半峰宽(PWHM)降低；但是，另一生物传感器输出参数，例如总体角位移(即共振峰的中心位置)可用于区分抑制剂和激活剂和完全无效的分子。PWHM是在峰最大强度(高度)一半处的峰上两点间连线的长度，如图6B所示。例如，当所有传感器上的细胞密度基本一致或大致相同时，细胞增殖的抑制剂产生的角位移往往小于完全未受处理的细胞，而激活剂产生的角位移往往大于细胞未经任何处理的传感器。所有分子的浓度相同时，可以通过分子对PWHM值的影响确定分子抑制(作为抑制齐U)或刺激(作为激活剂)细胞增殖的效能或能力。与共振峰中心位置的变化联用，预先确定的PWHM变化值可用来过滤出抑制剂或激活剂。取决于检测给定模式共振峰所用的解调系统，PWHM的单位或数值可以不同。例如，对于角度解调系统，单位可以是度。例如，PWHM的变化度数可以是千分之一、千分之二、千分之三、千分之五、千分之七、或千分之十。 (iii)峰形可采用的另一生物传感器输出参数是总体峰形、或在某强度“之间”或该处的峰形。例如，可采用最大峰强度一半、或任何其它强度(例如30%、40%、70%、或88%、或20-100%的任何百分数)处的峰形作为生物传感器输出参数。形状可以用特定强度之下或之上的峰面积鉴定。例如，在最大峰强度的一半处，有一个峰前强度点和一个峰后强度点。可以在这两点间划线，可以确定共振峰内该线上面的面积或共振峰内该线下面的面积并成为生物传感器输出参数。应当理解给定峰的积分面积也可用于分析分子作用于细胞的影响。另一种涉及形状的生物传感器输出参数可以是特定峰强度的共振峰宽度。例如，可以通过测量50%峰强度的共振峰上峰前强度点和50%峰强度的峰后线上点之间连线的尺寸来确定最大峰强度一半处的共振峰宽(HMPW)。该测量可用作生物传感器的输出参数。应当理解可以用这一方式确定20到100%峰强度之间任何强度的的共振峰宽度。(实施例可参见附图，例如图6B)。(C)生物传感器共振带图像的相关参数目前，多数光生物传感器一次一项地监控靶分子与固定在传感器表面的探针分子的结合、或者传感器表面的细胞粘着或细胞活力。对于多个生物传感器上的结合事件或细胞粘着或细胞活力，研究人员通常以时序的方式监控这些事件。因此，不同传感器之间的直接比较是个挑战。此外，这些检测系统不论是波长或是角度解调都采用小点ri00-500i!m直径)的激光照射传感器。应答或共振峰代表照射区域的平均细胞应答。对于96孔生物传感器微孔板(例如康宁的Epic微孔板)，各RWG传感器约为3x3mm2并位于各孔底部，而对于384孔微孔板形式，传感器尺寸一般为lxlmm2。因此，采用现有传感器技术所得应答仅代表传感器表面的一小部分。理想地，检测系统应不但能同时监控附着在多个生物传感器上的活细胞应答，还能对各传感器上的较大区域或多个区域进行信号解调。由成像光学解调系统(例如CXD相机)得到的共振带是通过考察，例如跨单个传感器限定位置反射(即出偶联的)光强度相比物理位置，产生的数据输出类型。反射光与入偶联光直接相关。或者，可以通过扫描解调系统采集共振带，采用小激光点照射传感器，以一维或二维形式扫描整个传感器、并采集给定导模的共振峰。最后可重新组成随传感器内位置而变化的共振峰或光强度以形成传感器的共振带。在生物传感器中，当产生特定波长的光或者当产生光使之以特定角度射到生物传感器上时，出偶联光随传感器表面/接近传感器表面的折射率的变化而改变，这种改变导致成像系统采集的各传感器的共振带的特征改变。此外，培养后细胞在整个传感器上的不均匀粘着可以采用共振带直接显现(例如，参见图I中圈注的共振带)。在理想的多孔生物传感器微孔板中，各传感器的位置相对其它生物传感器标准化；即传感器通过微孔板中整行或整列各孔的中心对齐。因此，所得共振带图像可用作细胞粘着或应答刺激的细胞变化的内部参照。因此，各给定模式传感器的共振带提供了涉及此带的可使用的额外参数以评价DMR或细胞影响。下面讨论其中的子集。⑴带形另一可采用的生物传感器输出参数是各给定模式生物传感器的共振带形状。所述形状由跨越各传感器较大区域的强度分布定义。所述形状可用于指示所粘附细胞的均一性或所述较大区域内响应刺激的细胞改变(例如，如图I所示，各共振带代表跨越整个大小为约200mmx3000mm的传感器的应答)。(ii)位置 和给定模式的各传感器共振峰的位置类似，各共振带的位置可用作生物传感器输出参数。可以采用成像软件定量强度以产生各带最大强度的中心位置。该位置可用于检测应答刺激或分子处理的细胞变化。(iii)强度正如共振带的位置，采用成像系统采集的出偶联光强度可用作生物传感器输出参数。整个带的平均强度或成像带中各像素的绝对强度可用于检测细胞粘附的质量并评价细胞应答。(iv)分布采用成像系统采集到的具有确定角度或波长的出偶联光的分布可用作生物传感器输出参数。该参数可在无固定细胞或探针分子时用于评估传感器本身的表面性质，也可检测传感器表面整个照射区域中细胞粘附的质量。同样，该参数还可在整个区域的细胞密度一致时用于检测分子对细胞影响的均一性；或在受照区域内某一部分与其它部分的细胞密度不同时用于检测细胞密度对分子诱导的细胞应答的影响。(V)宽度正如给定模式共振峰的PWHM，采用成像系统获得的共振带宽度可用作生物传感器输出参数。该参数和共振峰的PWHM值具有几乎相同特征，进而共享有用信息内容，区别在于，本参数能获得传感器受照区域多个区域的多个带宽，而不是只有一个PWHM用于共振峰。与其它通过共振带成像获得的参数相似，宽度可用于上述应用。对于采用本文所公开生物传感器的任何细胞试验给定应用，所有这些参数可独立使用或一起使用。使用参数的任何子集或组合可为给定试验或具体试验的给定变化产生特征，例如用于细胞受体试验的特征，和进一步用于基于EGF受体试验的特定特征。B.方法I.测定定靶药理学的方法本文公开了测定分子的定靶药理学的方法。所述无标记定靶药理学的方案涉及无标记细胞试验和无标记整合药理学。本文公开了联合用多个试验模式与无标记细胞整合药理学方案以测定有更高分辨率的分子定靶药理学的方法。
所述方案克服传统无标记细胞试验和无标记整合药理学的分辨率和可检测细胞事件两者的局限。因此，本文所述的方法提供分子定靶药理学的高分辨率特性。传统无标记细胞试验大多检查分子刺激后的生物传感器细胞反应，和/或测定分子对通过特定受体(例如G-蛋白偶联受体(GPCR)，受体酪氨酸激酶(RTK)等)介导的所述生物传感器细胞反应的效果。所述试验单独或共同研究分子药理学。然而，无标记细胞试验本质上是非特异性并且提供整合的细胞反应。另外，无标记细胞试验对生物传感器输出信号有偏向，即对光学生物传感器而言，其偏向动态质量再分布(DMR)，而电生物传感器偏向离子再分布。同样，传统的无标记细胞试验多数用于监控早期细胞信号转导事件。已知受体激活引起通常由数千个细胞靶标组成的精细信号网络相互作用，其中很多不影响所获得的生物传感器信号。很多细胞事件或过程也缓慢发生。因此，不可能全部理解使用传统无标记细胞试验的所述分子定靶药理学。在一些实施方式中，所述方法使用生物传感器细胞反应组在特定和预定时域对分子的无标记药理学进行数字描述。 在一些实施方式中，所述方法使用相似性聚类或聚类分析方法在其无标记细胞整合药理学方面分类所述分子或分类所述分子药理学。在一些实施方式中，所述聚类分析能关联体外分子的无标记整合药理学与体内药理学，因此能产生药物重新定位和新药物组
口 o使用现有肾上腺素能受体药物作为模型显示无标记细胞整合药理学与其各自体内适应直接相关。在一些实施方式中，所述分子能靶向G蛋白偶联受体和受体酪氨酸激酶。所公开的方法涉及无标记细胞试验和无标记细胞整合药理学。本文公开了使用试验模式组来测定分子药理学通过特异靶标作用的重要方面的方法。在一些实施方式中，所述试验模式可以是但不限于，持续激动刺激、顺序拮抗刺激、反向顺序刺激、与通路调节剂的共刺激和不同通路标记组的调节。在一些实施方式中，所述方法使用描述分子无标记整合药理学的多个数字矩阵测定分子的定靶药理学。在一些实施方式中，所述方法鉴定受体药物分子。2.试验模式本文公开了使用试验模式组鉴定所述定靶药理学的方法。a)持续激动刺激试验所述持续激动刺激试验或类似术语指对仅用分子刺激后的细胞反应进行测试，其中通过单独加入含有分子的溶液到缓冲溶液中，用没有后续除去分子的传统液体处理技术例抽吸(pippetting)覆盖细胞,使所述分子接触细胞。在所述试验中，所述细胞在所有时间暴露于所述分子，产生持续刺激条件。持续激动刺激试验的示例示于图1A，其中所述A431细胞在刺激后所有时间暴露于沙丁胺醇。b)拮抗试验所述拮抗试验或类似术语指两步试验，其中细胞先暴露于分子，然后用受体激动剂刺激。所述受体激动剂能是感兴趣受体的内源性激动剂。所述两步经常被特定时间段(例如10分钟、30分钟、60分钟、90分钟、2小时、5小时或I天)分开。对无标记细胞试验，两个刺激之间的分开时间通常为小时。所述试验测定所述分子调节、或拮抗、或增强所述激动剂诱导的生物传感器信号的能力。所述试验是顺序刺激试验的特定示例。图IG中显示了一个例子，其中A431细胞先用沙丁胺醇刺激，再用P2AR激动剂肾上腺素刺激。在图IG中，两步分开飞O分钟，只监控第二步，并且两个步骤中的所有时间都有沙丁胺醇。c)顺序刺激试验所述顺序刺激试验或类似术语指两步试验，其中细胞先暴露于分子，然后用参照分子刺激。所述参照分子能是所述受体的激动剂、拮抗剂或反向激动剂。图IB中显示了一个例子，其中所述参照分子是所述P2-AR反向激动剂普萘洛尔。普萘洛尔的反向激动通过其逆转P2AR激动剂(例如异丙基肾上腺素和肾上腺素)的DMR信号的能力来证明。如图IG所示,拮抗试验也是顺序刺激试验的示例。d)共刺激试验所述共刺激试验或类似术语指一步试验，其中用含有感兴趣分子和参照分子的混合物溶液(cocktail solution)刺激细胞。所述参照分子能是受体下游的通路调节剂。图 IC中显示了一个例子，其中所述参照分子是所述腺苷酸环化酶激活剂毛喉素。腺苷酸环化酶是Gas和Gai介导信号转导下游的酶。e)反向顺序刺激试验所述反向顺序刺激试验或类似术语指两步试验，其中细胞先用受体激动剂刺激，然后用分子刺激。所述受体激动剂能是受体的内源性激动剂。图ID中显示了一个例子，其中所示细胞分别用P2AR激动剂肾上腺素和分子沙丁胺醇顺序刺激。在图ID中，只监控和显示第二步。两步都有肾上腺素。f)调节试验所述调节试验或类似术语指两步试验，其中细胞先用参照分子刺激，然后用分子刺激。所述参照分子能是通路调节剂，例如酪蛋白激酶2 (CK2)抑制剂TBB、或PI3K抑制剂LY294002、或ROCK抑制剂Y27632、MEK抑制剂UO126、或分别使相应G蛋白Gai和Gas丧失能力的毒素(例如，霍乱毒素、百日咳毒素)。图IE中显示了一个例子，其中所述A431细胞先用已知酪蛋白激酶2抑制剂TBB刺激小时，然后用分子沙丁胺醇刺激。在图IE中，只监控和显示第二步。两步都有所述CK2抑制剂TBB。图IF中显示了另一个例子，其中所述A431细胞先用已知Gai蛋白杀伤剂百日咳毒素处理过夜，然后用分子沙丁胺醇刺激。图IF中，百日咳毒素处理过夜来预调理所述细胞。g)调节概况试验所述调节概况试验或类似术语涉及测试在相同细胞中调节标记组的分子。每个标记是特定细胞通路或细胞过程的激活剂。图IH中显示了一个例子，其中A431细胞先用分子沙丁胺醇刺激约I小时，然后用下列四个不同标记分别刺激内源性P 2AR激动剂肾上腺素(Epi )、内源性GPR109A激动剂烟酸(NA)、内源性EGFR激动剂EGFjP内源性HlR受体激动剂组胺(His)。所述对各标记的调节百分比计算是基于分子存在时一个或两个标记DMR反应的特定DMR事件对分子缺乏时相应反应的标准化对肾上腺素DMR为P-DMR事件、对烟酸DMR为P-DMR事件、对EGF DMR为P-DMR和N-DMR事件、和组胺DMR为P-DMR。在图IH中，所述标记是2nM肾上腺素、I u M组胺、32nM表皮生长因子和I U M烟酸。在所有实验中，所述沙丁胺醇浓度是10 PM。h)不同试验条件下描述所述分子DMR信号的数字矩阵
本文公开了不同条件下数字描述任何DMR信号的方法。本公开方法依赖于细胞信号传播的动力学，经常涉及时间和空间动态并且由调节机制如磷酸化调控或门控。因为无标记生物传感器细胞试验测量活细胞在刺激后的整合和动力学反应，所述试验本质上是多重的。因为不同生物传感器反应也显示不同动力学和动态，难于应用简单策略来测定对广泛生物传感器信号而言生物传感器事件的阶段和幅度，特别是对于大规模筛选数据组。因此，需要简单数字描述数字矩阵。本文公开了使用特定和预定时域响应作为数字矩阵来描述任何DMR信号的方法。所述时域响应组能覆盖从起始第二信使相关事件到中间信号事件(如运输)并且到细胞形态变化的细胞信号转导不同的波。所述时域响应的数字应该足够大以有代表性，但是应该足够低从而可用于完成相似性分析。在一些实施方式中，所述时域响应的数字在范围3-20内。在一些实施方式中，所述时域响应的数字在范围3-15内。在一些实施方式中，所述时域响应的数字在范围3-10内。在一些实施方式中，所述时域响应的数字在范围3-7内。在一些实施方式中，所述时域响应的数字在范围3-5内。例如，不同时间段测量所述代表性时域，包含刺激后0-3分钟、3-6分钟、6-10分钟、10-20分钟、20-50分钟、50-120分钟。对^ 2AR定靶药理学分析而言，所述时域能是刺激后3、5、9、15和50分钟，意味着每个时间点 的实际信号用于描述特定试验条件下获得的每个DMR信号。示例是如图IA所示的持续刺激条件下沙丁胺醇DMR信号的数字描述(_29、7、89、155和199皮米，时间点为刺激后3分钟、5分钟、9分钟、15分钟和50分钟)。对诸如Epic系统的RWG生物传感器而言，所述反应是测量有活细胞的生物传感器系统在刺激后的共振波长移位。i)聚类分析本文公开了使用聚类算法方案对作用于相同靶标受体的分子体外药理学进行分类的方法。在一些实施方式中，所述聚类算法方案可以是一维或二维聚类算法方案。在一些实施方式中，所述聚类算法可以是但不限于，分级、k-均值、FORCE和MCL聚类。所述分级聚类方法是试图基于关联建立聚类分级的聚类分析方法(见Hastie，T.，Tibshirani, R. , Friedman, J. (2009). "14. 3. 12 Hierarchical clustering (分级聚类)〃收录于The Elements of Statistical Learning (《统计学习基础》)(第2版),纽约施普林格出版社(Springer)，第520 - 528页和其引用的参考文献)。所述K均值聚类是分隔算法，将数据分入k不重叠聚类,其中k是输入参数,但也是聚类数(见Hastie, T. , Tibshirani, R. , Friedman, J. (2009), The Elements ofStatistical Learning (《统计学习基础》)(第 2 版)，纽约施普林格出版社，第509 - 513页和其引用的参考文献XK均值聚类的一个缺点是聚类数必须事前选择，并且通常接近节点数的1/2的平方根。马尔可夫(Markov)聚类算法(MCL)是图中基于流体模拟图的快速分裂聚类算法。对无标记整合药理学方案而言，本文所述公开的实验示例中使用分级聚类。聚类是应用在统计学、计算机科学、生物学、社会科学或心理学中对探索性数据分析广泛建立的技术。在任何基础科学领域应用经验数据以得到结构相似性的初始印象。为此目的，能广泛用于大范围数据类型的有效和易于使用的工具具有极大优势。然而，前面还没有研究无标记细胞试验中所述聚类分析的应用。所述聚类分析通常使用传统配对相似性函数进行以测定数据组中每个无序对的相似性(或距离)，产生相似性数字矩阵。所述传统逐对比对相似性函数可以是但不限于分级和k-均值。分级和k均值都用于聚类表达或遗传数据。分级和k-均值聚类可以显示为节点的分级组或热图。也能使用其他已知方法，例如MCL和FORCE。MCL和FORCE都产生可折叠“元(meta)节点”以交互式研究推定的家族关联，并且因此经常用于聚类相似性网络以检索蛋白家族(和推定功能相似性)。分级聚类是试图建立聚类分级的聚类分析方法。分级聚类的策略通常有两种集结和分解。所述集结聚类是“由下而上”方法一每个观察开始于其自己的聚类，并且当其向分级上部移动时，汇集聚类对。所述分解聚类是“由上而下”方法一所有观察在一个聚类开始，并且当其向分级下部移动时，递归分裂。为了决定哪些聚类应该组合(对集结而言)，或何处应分开聚类(对分解而言)，需要测量观察组之间的区别。在多数分级聚类的方法中，这通过使用合适距离度量(测量观察对之间的距离)，和确定组之间区别作为组观察中配对距离的函数的关联标准来完成。所述合适度量的选择会影响聚类的形状，因为一些元素可以根据某一距离彼此接近和根据另一距离相互远离。通常距离度量包含欧几里德距离、平方 欧几里德距离、曼哈顿距离、最大化距离、马氏(Mahalanobis)距离和余弦相似度。例如，所述欧几里德距离能用于无标记整合药理学应用，并且在本公开实验示例中通篇使用。相似性和区别是两个节点之间的距离函数。所述相似性和区别基于节点的边缘属性测量。分级聚类构建系统树(二进制树)，从而更多相似性节点可能会更近关联入所述树。分级聚类用于组织数据以获得对数据值之间和聚类之间的配对关系的认知。所述系统树通过用关联标准生成。所述关联指两个组之间“接近性”的测量。关联标准测定作为观察之间配对距离函数的观察组之间距离。有四种不同类型的关联。在如分级聚类的集结聚类技术中，在所述算法的每个步骤上，选择要合并的所述两个最接近组。关联方法包含(1)配对平均关联(即两组中所有配对元素间的平均距离)，(2)配对单独关联(即两组中所有配对元素间的最小距离)，(3)配对最大关联(即两组中所有配对元素间的最大距离)和(4)配对质心关联(即两组中所有配对元素质心间的距离)。例如，所述配对最大关联能用于无标记整合药理学应用。对分级聚类而言，有数种方式计算用于构建聚类的距离数矩阵。通常，所述距离代表数字矩阵中两排(通常代表节点)之间的距离。所述距离度量可以是但不限于，(I)欧几里德距离，两排之间的简单二维欧几里德距离，计算作为不同值之间差异的平方和的平方根；
(2)市块距离，两排之间的值差异的绝对值之和；(3)皮尔逊(Pearson)相关，相比较的两排的值的皮尔逊积矩系数。所述值通过将两排的协方差除以标准偏差的乘积来计算；(4)皮尔逊相关，类似于(3)所示值的绝对值，但是使用两排的协方差的绝对值；(5)非中心相关，是标准皮尔逊相关，包含以零附近的平方和为中心的形式。所述度量没有尝试以平方和为中心。(6 )中心相关，类似于(5 )所示值的绝对值，但是使用两排的协方差的绝对值；(7 )史皮尔曼(Spearman)等级相关系数,史皮尔曼等级相关(P )是两排之间相关性的非参数度量；(8)肯德尔(Kendall) x，两排之间分级相关系数(t )。发现无标记整合药理学的距离度量的选择取决于数据类型。例如，非中心绝对相关能用于定靶药理学分类。所述相似性分析还能使用预先定义的聚类阈值(密度参数，也称为相似性阈值)来计算相似性数字矩阵。所述阈值给出相似和不同对象之间的边界，并且因此用于控制聚类分析的密度。高(限制性)值使得增加大部分所述边缘时花费更大，造成很多小聚类。另一方面，更低的值使加入边缘时便宜，但是除去这些却昂贵，造成一些大的聚类(意味着更低的分辨率)。对无标记整合药理学而言，所述聚类阈值可变，并且经常依赖于所需聚类的分辨率。对无标记整合药理学而言，数据包含所有能用于分级聚类的数字节点和边缘属性的列表。例如，所述节点能是分子。所述边缘属性代表分子的反应，或者单独(即细胞中对分子初级概况的特定时间i的给定反应)，或者代表分子对标记的调节百分比(即通过特定浓度的分子，所述标记生物传感器反应的调节百分比，例如P-DMR或N-DMR)。必须选择至少一种边缘属性或一种或多种节点属性来进行聚类。如果选择边缘属性，所得数字矩阵在列和排两者的节点的对角线上对称。如果选择多个节点属性，所述特性会定义列且所述节点是排。在某些环境下，需要仅聚类网络节点的亚组。例如，为鉴定共有特定作用模式的分子，检测只显示所述作用模式的节点的亚组。对无标记整合药理学方法而言，有效聚类需要某些标准化或数据预处理。例如，可能需要数据过滤。对基于分子生物传感器初级指数的相似性分析而言，有效数据过滤指使用最大最小差异(如在刺激后一小时内，只有DMR信号不同时间点之间最大最小差异大于 40皮米的分子可进行相似性分析)。对无标记定靶药理学研究而言，能使用一维和二维聚类分析。所述一维聚类主要关注分子(节点)间的相似性。所述双向聚类、共聚类或二聚类是不仅聚类所述节点(即对象、分子)而且聚类所述节点的特性(即边缘属性)的聚类方法，即，如果数据在数据矩阵中表示，同时聚类所述排和列。所述二维聚类包含聚类属性和节点。在所述方法中，所述聚类算法会运行两次，首先用数字矩阵中代表节点的排和代表属性的列。所得系统树提供给定属性值的节点的分级聚类。在第二个路径中，转置所述数字矩阵并且排代表特性值。这提供聚类属性的系统树。能看到基于节点和基于属性的系统树。如本公开实施例所示，第一聚类能根据其相似性和区别方面聚类分子。第二聚类会用于不同目的，这取决于无标记整合药理学分析的类型。所述相似性分析通常产生由互相关联或独立的分子聚类组成的系统树，每个分子聚类共有相似的作用模式(即药理学)。所述聚类也能视作热图。热图是数据的图示，其中颜色表示由二维图中变量得到的值。一个非常相似的表示形式是树图。热图源自显示数据矩阵中值的2D展示。红色方块表示阳性值和绿色方块表示阴性值。更深颜色正方形显示较大值，而更浅颜色正方形显示更小的值(图2的示例)。聚类结果经常变换矩阵中的排和列以根据聚类安排相似结果互相临近。基因表达分析和蛋白网络分析的相似性分析产生三种类型的流行热图显不，包含HeatMapView(未聚类)、Eisen TreeView和Eisen KnnView0所述热图显示方法能在其无标记整合药理学方面直接用于观察分子的聚类和关系。基因表达分析经常显示节点(即基因)和许多节点属性(通常在不同实验条件下表达数据)的分级聚类结果。基于无标记整合药理学的聚类也显示节点(即分子)和许多节点属性的分级聚类的结果。然而，使用的所述节点(note)属性依赖于分析的类型。对定位靶标药理学分类而言，所述节点属性能是在不同试验条件下分子刺激细胞后的多个时间点的分子生物传感器信号/反应的真实值。所述节点属性也可以是分子相对对标记组中每个标记的调节百分t匕。所述调节百分比经常通过将分子存在时所述标记生物传感器的反应与分子缺失时所述标记生物传感器的反应标准化来计算。所述标准化通常基于特定生物传感器事件的信号振幅(如P-DMR、N-DMR或RP-DMR)，但不是各事件的动力学，因为这是信号振幅而不是动力学，与分子有效性(当分子是通路或细胞过程的激动剂或激活剂时)或效能(当分子是通路或细胞过程的拮抗剂或抑制剂时)相关。在迄今开发的热图显示方法中，所述Eisen TreeView是最常见方法。本文分级聚类结果通常用数据值的彩色编码“热图”和聚类的系统树一起显示。或者，当使用K均值聚类时，所述结果能用Eisen KnnView显示。C.定义LA除非上下文中另有明确说明，在本说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一个”，“一种”和“该”或类似术语包括复数指示物。因此，例如“一种抑制剂”包括两种或更多抑制剂和类似物的混合物等。
2.缩写可采用本领域普通技术人员熟知的缩写(表示小时的“h”或“hr”，表示克的“g”或“gm”，表示毫升的“mL”，表示室温的“rt”，表示纳米的“nm”以及类似缩写)。3.约本公开的实施方式描述中采用对例如，组合物中成分的量、浓度、体积、处理温度、处理时间、产率、流速、压力、和类似数值，及其范围进行修饰的约是指可能发生的数值量变化，例如，通过制备化合物、组合物、浓缩物或使用制剂所用的常规测量和操作过程；通过这些过程中的偶然性误差；通过用来进行所述方法的起始材料或成分的生产、来源或纯度的差异；和类似因素。术语“约”还包括由于具有特定初始浓度或混合物的组合物或制剂的陈化而不同的量，以及由于混合或加工具有特定初始浓度或混合物的组合物或制剂而不同的量。无论是否受术语“约”修饰，所附权利要求书均包括这些量的等同形式。4. “整个细胞组和针对标记组”短语“整个细胞组和针对标记组”是指检测分子作用于细胞组内各细胞的初级概况以及分子调节标记组的调节概况的系统过程。对于标记/细胞对，所述过程首先从检测分子独立作用于每个类型细胞的初级概况开始，然后检测相同细胞内标记在分子存在下的二级概况。术语“针对”具体用于表示分子调节标记诱导的生物传感器应答的能力。5.激动和拮抗模式激动模式或类似术语是指细胞暴露于分子以确定所述分子引起生物传感器信号如DMR信号的能力的试验，而拮抗模式是指细胞在分子存在情况下暴露于标记以确定所述分子调节细胞响应所述标记的生物传感器信号的能力的试验。6. “另一时间段”“另一时间段”或“延长一时间段”或类似术语是在某一时间段或治疗后顺序发生的时间段。所述时间段可大幅变化，10分钟-I小时、2小时、4小时、8小时或24小时。7.概况概况或类似术语是指对组合物，例如细胞采集到的数据。如本文所述，概况可以从无标记的生物传感器采集。8.脉冲刺激试验“脉冲刺激试验”或类似术语可用于细胞仅暴露于分子中极短时间(例如，数秒、或数分钟)的情况。这种脉冲刺激试验可用于研究分子作用于细胞/靶标的动力学，及其对标记诱导的生物传感器信号的影响。可以通过在添加分子后的给定时间用液体操作装置简单地将分子溶液替换成细胞试验缓冲液来完成脉冲刺激试验。9.测试测试、试验或类似术语是指用以确定物质如分子或细胞特征的分析，例如细胞受一种或多种外源刺激如配体或标记刺激后光学或生物阻抗应答的存在、缺乏、量、程度、动力学、动态或类型。产生细胞响应刺激的生物传感器信号可以是试验。10.试验模式一种或多种“试验模式”或类似术语指试验的特定类型，例如持续激动刺激试验、拮抗试验、顺序刺激试验、反向顺序刺激试验、共刺激试验、调节试验和调节概况试验。11.测试应答“测试应答”或类似术语是指采用某一方法来鉴定应答。例如，若使分子与细胞接·触，可以采用生物传感器测试细胞在暴露于所述分子后的应答。12.结合“结合”、“附着”、“粘附”、“粘着”、“贴壁”、“固定化”、或类似术语一般指例如，表面
修饰物质、相容剂、细胞、配体候选分子、和本公开的类似实体通过物理吸附、化学结合、和类似过程或其组合固定化或固着在表面上。具体而言，“细胞附着”、“细胞粘着”或类似术语是指细胞与表面的相互作用或结合，例如通过培养、或与细胞锚定材料、相容剂(例如纤连蛋白、胶原蛋白、核纤层蛋白、明胶、聚赖氨酸等)相互作用、或两者一起。“贴壁细胞”、“固定化细胞”或类似术语是指保持与基底外表面结合、固定或某种接触的细胞或细胞系或细胞系统，例如原核或真核细胞。这类细胞在培养后能承受或经受清洗和介质交换过程而保持附着，所述过程是很多基于细胞的试验的先决条件。13.生物传感器生物传感器或类似术语是指用于检测分析物的结合了生物组件和理化检测器组件的装置。生物传感器通常由三部分组成生物组件或元件(例如组织、微生物、病原体、细胞、或其组合)、检测器元件(以理化方式例如光学、压电、电化学、热学或磁力运作)、和与两种组件关联的换能器。生物组件或元件可以是例如，活细胞、病原体或其组合。在实施方式中，光学生物传感器可以包括将活细胞、病原体、或其组合中的分子识别或分子刺激事件转化成可量化信号的光换能器。14.以生物传感器细胞试验为核心的细胞概况药理学“以生物传感器细胞试验为核心的细胞概况药理学”或类似术语是采用无标记生物传感器细胞试验确定分子的药理学的方法。15.生物传感器指数“生物传感器指数”或类似术语是由生物传感器数据的集合构成的指数。生物传感器指数可以是生物传感器概况，例如初级概况、或二级概况的集合。所述指数可以包含任何种类的数据。例如，概况的指数可以只包括N-DMR数据点，它可以是P-DMR数据点、或者两种都有或者它可以是阻抗数据点。它可以是与概况曲线相关的所有数据点。16.生物传感器应答“生物传感器应答”、“生物传感器输出信号”、“生物传感器信号”或类似术语是指具有细胞的传感器系统对细胞应答的任何反应。生物传感器将细胞应答转化成可量化的传感器应答。生物传感器应答是由光生物传感器例如RWG或SPR测得的对刺激的光学应答或者是由电生物传感器测得的细胞在刺激后的生物阻抗应答。因为生物传感器应答与刺激后的细胞应答直接相关，在公开的实施方式中，生物传感器应答和细胞应答可以互换使用。17.生物传感器信号“生物传感器信号”或类似术语是指生物传感器测得的由细胞受刺激后应答产生的细胞信号。18.生物传感器表面生物传感器表面或类似术语是指能在其上具有培养细胞的任何生物传感器的表面。所述生物传感器表面能用组织培养物处理，或细胞外基质材料(如纤连蛋白、层粘连蛋 白、胶原等)包被或合成材料(如聚赖氨酸)包被。19.细胞细胞或类似术语是指外部被半透膜限定的小且通常为微观量的原生质，可选包括一个或多个核和各种其它细胞器，能独自或与其它类似物质相互作用运行生命的所有基本功能，并形成能独立作用的活性物质的最小结构单元，包括合成细胞构建体、细胞模型系统和类似人工细胞系统。细胞可包括不同的细胞类型，例如与特定疾病相关的细胞、来自特定来源的细胞类型、与特定靶标相关的细胞类型、或与特定生理功能相关的细胞类型。细胞还可以是天然细胞、工程细胞、转化细胞、永生细胞、原代细胞、胚胎干细胞、成人干细胞、诱导多能干细胞、肿瘤干细胞、或干细胞衍生的细胞。也能使用包含至少两种类型细胞的细胞系统。所述细胞系统能自然形成或通过共培育形成。人体由约210种已知的不同细胞类型构成。考虑到细胞的制备方式(例如工程改造、转化、永生化、或新鲜分离自人体)和获取细胞的来源(例如不同年龄或不同疾病阶段的人体等)，细胞类型的数目几乎是无限的。20.细胞生物学方法“细胞生物学方法”或类似术语是指涉及研究细胞一其生理学特性、结构、所含细胞器、与环境的相互作用、生命周期、分裂和死亡的科学方法。这在显微和分子水平上完成。知晓细胞的组成和细胞如何工作是所有生物科学的基础。21.细胞培养“细胞培养”或“细胞培育”是指原核或者真核细胞在受控条件下生长的过程。“细胞培养”不单指衍生自多细胞真核生物的细胞，特别是动物细胞的培养，也指复合组织和器官的培养。22.细胞组“细胞组”或类似术语是指包括至少两种细胞的组。所述细胞可以是本文公开的任何种类的细胞或组合。23.细胞背景“细胞背景”或类似术语是有特定状态的细胞类型。例如，不同细胞的类型有不同的细胞背景(如细胞受体的差异表达或组成)。相同类型但有不同状态的细胞也有不同的细胞背景。通过培养(例如细胞周期停滞或增殖或静息状态)或处理(例如不同药理学试剂处理的细胞)能形成所述相同类型但有不同状态的细胞。
24.细胞过程细胞过程或类似术语是指在细胞内或通过细胞发生的过程。细胞过程的例子包括但不限于，增殖、凋亡、坏死、分化、细胞信号转导、极性变化、迁移或转化。25.细胞概况药理学“细胞概况药理学”或类似术语采用无标签生物传感器，特别是光生物传感器，产生细胞响应单独刺激或与分子一起刺激的初级概况，和细胞在没有分子时响应单独刺激或与标记分子组一起刺激的二级概况。初级概况和二级概况的集合、及其所得调节概况被独立或集中用于确定分子的药理学。26.细胞应答“细胞应答”或类似术语是指细胞对刺激的任何反应。27.细胞靶标 “细胞靶标”或类似术语是指能通过外部刺激改变活性的生物聚合物例如蛋白质或核酸。细胞靶标是最常见的蛋白质，例如酶、激酶、离子通道和受体。28.组分公开了用于制备所公开组合物的组分和本文所述方法中使用的组合物本身。本文公开了这些和其它的材料，应理解当公开这些材料的组合、子集、相互关系、组等等而未明确地具体提及这些分子的每个不同的单独和集体组合以及这些分子的排列时，在本文中具体设想和描述了它们中的每一种情况。因此，如果公开了一类分子A、B、和C且公开了一类分子D、E、和F和分子组合A-D的实施例，则即使没有分别列举每个单独和共同视为有意义的组合，也应当认为公开了 A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-EjP C-F。同样，还公开这些组合的任意子集或组合。因此，举例来说，应认为已公开亚组A-E、B-F和C-E。此观念可适用于本申请的所有方面，包括但不限于制造和使用所公开组合物的方法。因此，如果存在可进行的多个附加步骤，应当理解可通过所公开方法的任一特定实施方式或实施方式的组合来进行这些附加步骤中的每一个。29.化合物和组合物复合物和组合物在本领域中具有标准含义。应当理解，在任何情况下，公开了具体名称例如分子、物质、标记、细胞、或试剂组合物，所述组合物包含这些名称、由其组成、和基本由其组成。因此，当使用具体名称标记时，应当理解还公开了包含该标记，由该标记组成、或基本由该标记组成的组合物。在适当之处，当给出具体的名称时，应当理解也公开了该名称的复合物。例如，当公开具体的生物材料，例如GPCR激动剂时，也公开GPCR激动剂的复合物形式。30.包含在本说明书的描述和权利要求中，词语“包含”和该词语的其它变化形式，如“含有”和“包括”，意味着“包括但不限于”并且不意在排除例如其它添加物、组分、整数、或步骤。31.主要由......组成实施方式中的“主要由……组成”指例如表面组合物、在本公开的生物传感器、制品、装置、或设备表面上制作或使用表面组合物、制剂或组合物的方法，还可包括权利要求中列出的组分或步骤，以及实质上不影响本公开组合物、制品、设备和制造及应用方法的基本和新性质的其它组分或步骤，如所选的特定反应物、特定添加剂或成分、特定试剂、特定细胞或细胞系、特定表面调节剂或表面条件、特定候选配体、或类似结构、材料或过程变量。可对本发明的组分或步骤的基本性质产生实质影响或可产生本发明不需要特征的项目包括例如，细胞对生物传感器表面的亲和性降低、刺激对细胞表面受体或胞内受体的异常亲和性、响应候选配体或类似刺激的异常或相反细胞活性、和类似特征。32.鉴定鉴定或类似术语是指收集关于物质，例如配体、分子、标记或细胞的任何性质的信息，例如获得配体、分子、标记或细胞的概况。33.化学生物学方式“化学生物学方式”或类似术语是指涉及应用化学技术和工具，通常是合成化学生成的化合物，进行生物系统的研究和操控的科学方式。一些形式的化学生物学尝试通过在化学水平直接探测活系统来回答生物学问题。与采用生物化学、遗传学或分子生物学这些能突变产生新型感兴趣生物体或细胞的研究相反，化学生物学研究有时采用为特定目的设 计或在基于生化或细胞筛选的基础上鉴定的小分子在体内和体外探测系统。34.接触接触(contacting)或类似术语是指,若至少两种物品，例如分子、细胞、标记、至少一种化合物或组合物、或至少两种组合物、或这些中的任意一种和制品或机器间可能发生的分子相互作用，使相互靠近从而能发生分子相互作用。例如，接触是指将至少两种组合物、分子、制品、或物品接触，即，使其接近以混合或碰触。例如，有组合物溶液A和培养的细胞B并将组合物溶液A倾倒到培养的细胞B上，使组合物溶液A与细胞培养物B接触。用配体接触细胞会将配体带到细胞以确保细胞能得到配体。应当理解本文公开的任何物品可与任何其它物品接触。例如，可以使细胞接触标记或分子、生物传感器等。35.对照术语对照或“对照水平”或“对照细胞”或类似术语定义为测量变化的标准，例如对照不进行实验，而是接受整套确定的参数，或对照是基于处理前或处理后的水平。它们或者与测试平行进行，或者在其之前或之后进行，或者它们可以是预先确定的标准。例如，对照可以指对象或客体或试剂等在除了略去受测过程或试剂或变量等以外按平行实验处理的实验所得结果，该结果用作判断实验效果的比较标准。因此，对照可以用来确定与过程或试剂或变量等相关的效果。例如，若所研究的是测试分子对细胞的影响，可以a)简单地记录细胞在分子存在下的特征，b)添加具有已知活性或无活性的对照分子、或对照组合物(例如，试验缓冲溶液(载剂))并记录影响，然后将测试分子的影响与对照进行比较。在某些情况中，一旦进行了对照，所述对照就可用作标准，不必再进行对照实验，而在另一些情况中每当要作出比较时都应平行进行对照实验。36.确定的通路“确定的通路”或类似术语是特定的通路，例如Ga q通路、Ga s通路、Ga i通路、G12/13、EGFR(表皮生长因子受体)通路、或PKC(蛋白激酶C)通路。37.检测检测或类似术语是指本公开中的设备和方法用于发现或感应分子诱导的细胞响应和区分对不同分子感应到的响应。38.(药物候选分子的)直接作用“直接作用”或类似术语是指(药物候选分子)作用于细胞的结果。39. DMR 指数“DMR指数”或类似术语是由DMR数据的集合构成的指数。40. DMR 应答“DMR应答”或类似术语是指采用光生物传感器的生物传感器应答。DMR指动态物质再分布或动态细胞物质再分布。P-DMR是阳性DMR反应，N-DMR是阴性DMR反应，并且RP-DMR是恢复性P-DMR反应。41. DMR 信号 “DMR信号”或类似术语指光生物传感器测得的由细胞受刺激后应答产生的细胞信号。42.药物候选分子药物候选分子或类似术语是指对其用作药物或药效团的能力进行测试的测试分子。该分子可视为先导分子。43.早期培养早期培养或类似术语是培养中通常涉及细胞融合度或细胞周期状态的细胞相对状况。早期培养是细胞培养趋向高融合度，大于或等于90%。时间少于或等于细胞倍增时间。44.功效功效或类似术语是指在理想或最优条件下产生所需规模效应的能力。这些条件区分了功效和相关的有效性概念，后者涉及在现实条件下的改变。功效是受体占用和启动分子、细胞、组织或系统水平应答的能力之间的关系。45.高融合度细胞融合度或类似术语指细胞能在培养基上或遍布培养基的覆盖率或增殖率。因为很多细胞类型能经历接触抑制，高融合度指在组织培养表面或生物传感器表面细胞培养达到高覆盖率(>90%)，并且对培养基中细胞的生长有显著限制。相反，低融合度(如40-60%的融合度)指在培养基中/上细胞生长有很小或没有限制，并且假定细胞在生长期。46.更高和抑制和类似词语术语更高、提高、提升或升高或类似术语或这些术语的变形是指提高到基础水平以上，例如与对照相比。术语低、更低、减少、降低或下降或类似术语或这些术语的变形是指降低到基础水平以下，例如与对照相比。例如，在向细胞内添加分子例如激动剂或拮抗剂之前或不存在添加时基础水平是正常体内水平。抑制或抑制形式或类似术语是指降低或遏制。47. “在分子存在下”“在分子存在下”或类似术语是指将培养的细胞接触或暴露于分子。所述接触或暴露可以在细胞接触刺激之前、或同时发生。48.指数指数或类似术语指数据的集合。例如，指数可以是含有一种或多种调节概况的列表、表格、文档、或编目。应当理解，可以由任何数据组合生成指数。例如，DMR概况可以有P-DMR,N-DMR和RP-DMR。可以采用完整的概况数据、P-DMR数据、N-DMR数据、RP-DMR数据、或其中的任意点、或这些数据的组合或其它数据生成指数。指数是任何此类信息的集合。通常，在比较指数时，所述指数具有类似数据，即P-DMR对P-DMR数据。49. “分子作用模式的指示剂”“指示剂”或类似术语是进行指示的物品。具体地，“分子作用模式的指示剂”是指能由分子和熟知调节剂具有相似作用模式来解释的物品，例如分子的生物传感器指数相较公知调节剂的生物传感器指数的相似性。50.细胞/标记在缺失和存在分子时的动力学应答 “细胞/标记在缺失和存在分子时的动力学应答”或类似短语指在缺失和存在分子时完整试验或部分试验时间系列的标记所诱导细胞应答，采用例如模式识别分析，其可直接用于检测分子的药理学或作用模式。51.已知调节剂已知调节剂或类似术语是指对至少一种已知靶标具有已知亲和性的调节剂。例如，抑制调节剂可以是P 2肾上腺素能(andrenergic)受体激动剂。52.已知调节剂DMR指数“已知调节剂DMR指数”或类似术语是由就已知调节剂采集的数据生成的调节剂DMR指数。例如，已知调节剂DMR指数可以由已知调节剂作用于细胞组的概况、和已知调节剂针对标记组的调节概况构成，每组标记针对细胞组中的一种细胞。53.已知调节剂生物传感器指数“已知调节剂生物传感器指数”或类似术语是由就已知调节剂采集的数据生成的调节剂生物传感器指数。例如，已知调节剂生物传感器指数可以由已知调节剂作用于细胞组的概况、和已知调节剂针对标记组的调节概况构成，每组标记针对细胞组中的一种细胞。54.已知调节剂DMR指数“已知调节剂DMR指数”或类似术语是由就已知调节剂采集的数据生成的调节剂DMR指数。例如，已知调节剂DMR指数可以由已知调节剂作用于细胞组的概况、和已知调节剂针对标记组的调节概况构成，每组标记针对细胞组中的一种细胞。55.已知分子已知分子或类似术语指具有已知药理/生物/生理/病理生理活性的分子，其精确作用模式可以是已知或未知的。56.库库或类似术语指集合。库可以是本文公开的任何物品的集合。例如，它可以是指数的集合，指数库；它可以是概况的集合，概况库；或者它可以是DMR指数的集合，DMR指数库；同样，它可以是分子的集合，分子库；它可以是细胞的集合，细胞库；它可以是标记的集合，标记库；例如，库可以是随机或非随机的，确定或不确定的。例如，公开了已知调节剂的DMR指数库或生物传感器指数库。57.配体配体或类似术语是指能与生物分子结合并形成复合物用于生物学目的的物质或组合物或分子。在生物系统中配体及其靶分子之间实际的不可逆共价结合是罕见的。配体与受体的结合改变了化学构象，即受体蛋白质的三维形状。受体蛋白的构象状态决定受体的功能状态。结合的趋势或强度称为亲和性。配体包括底物、阻断剂、抑制剂、激活剂和神经递质。放射性配体是放射性标记的配体，而荧光配体是荧光标记的配体；两者都可视为配体，常用作受体生物学和生物化学研究中的示踪剂。配体和调节剂可互换使用。58.长期试验“长期试验”或类似术语用于研究给定分子对活细胞的长期影响。一种具体的长期试验是“长期生物传感器细胞试验”。在一种实施方式中，每个类型的细胞仅暴露于所述分子一段较长的时间(例如，8小时、16小时、24小时、32小时、48小时、和72小时)。这一长期试验用于确定分子对细胞健康状态(例如，活力、凋亡、细胞周期调节、细胞粘附调节、增殖)的影响。这一长期试验还包含可直接用于分子诱导细胞信号转导事件或通路研究的早期细胞信号转导应答(例如，分子刺激后30分钟、60分钟、120分钟、180分钟)。在另一种实施方式中，标记存在下的长期生物传感器细胞试验用于研究长期交叉 调节对分子和标记间细胞生物学和生理学的影响。标记的添加可以在分子之前、同时、和之后。例如，当标记(例如，H2O2)引发细胞组中至少一种细胞的凋亡时，可以采用这种长期试验确定分子是否是保护性的。反之，这种长期试验也可用于确定标记对分子诱导的细胞事件(例如，凋亡、或坏死)的保护或协同作用。59. “长期生物传感器信号”“长期生物传感器信号”是长期试验产生的生物传感器信号。60. “长期 DMR 信号”长期DMR信号或类似术语是指长期光生物传感器细胞试验产生的光生物传感器信号。61 低 CO2 环境低CO2环境是少于4. 5%C02的环境。62.标记标记或类似术语是指在生物传感器细胞试验中产生信号的配体。所述信号还必须是至少一种特定的细胞信号转导通路和/或至少一种特定靶标介导的至少一种特定细胞过程的特征。所述信号可以是阳性、或阴性、或任何组合(例如振荡)。63.标记生物传感器指数“标记生物传感器指数”或类似术语是由就标记采集的数据生成的生物传感器指数。例如，标记生物传感器指数可以由标记作用于细胞组的概况、和标记针对标记组的调节概况构成，每组标记针对细胞组中的一种细胞。64.标记DMR指数“标记DMR指数”或类似术语是由就标记采集的数据生成的生物传感器DMR指数。例如，标记DMR指数可以由标记作用于细胞组的概况、和标记针对标记组的调节概况构成，每组标记针对细胞组中的一种细胞。65.标记组“标记组”或类似术语是包括至少两种标记的组。标记可以针对不同的通路、相同的通路、不同的靶标、或甚至相同的靶标。66.材料
材料是用于构成物理实体的某种物品(化学的、生物化学的、生物的、或混合的)的
有形部分。67.数字矩阵数字矩阵或类似术语是能包含数学元素(例如生物传感器反应数据)阵列的物品，所述数学元素能组合形成有相似阵列的和以及乘积，所述相似阵列是有合适数量的排和列或把元素简单矩形排列成排和列。所述数字矩阵可以对进行分析的方式和所得结果的质量有显著影响。例如，在本公开的实施方式中，所述数字矩阵能是用于描述任何DMR信号的特定和预定时域响应的组。另一个示例是选择用以鉴定分子的细胞试验组的数字矩阵，包括但不限于，例如，持续激动刺激、顺序拮抗刺激、反向顺序刺激、与通路调节剂的共刺激和不同通路标记组的调节。在另一种实施方式中，可以用至少两种试验的混合群体作为系统。另一个示例是由选择细胞组用以鉴定分子所组成的数字矩阵，包括但不限于，例 如特定的疾病(例如负责过敏反应、或炎性疾病、或致病感染、或乳腺癌、或皮肤癌、或结肠癌、或肝病、或胰腺癌、或心脏病等的细胞组)、或特定的来源(例如，各组神经细胞、或肺细胞、或皮肤细胞、或肌肉细胞、或肝细胞等)、或特定的细胞祀标(例如，受体、或酶、或激酶、或癌基因、或结构蛋白、或DNA、或RNA)、或广泛的人生理或病理生理代表性细胞类型(例如，由角化上皮细胞、湿分层屏障上皮细胞、外分泌上皮细胞、激素分泌细胞、代谢和储存细胞、屏障功能细胞(肺、肠、外分泌腺和泌尿生殖道)、上皮细胞内层(lining)封闭的内部体腔、有推进功能的纤毛细胞、胞外基质分泌细胞、收缩细胞、血液和免疫系统细胞、感觉转导细胞、自主神经元细胞、感觉器官和外周神经元支持细胞、中枢神经系统神经元和胶质细胞、透镜状细胞、色素细胞、生殖细胞、抚育细胞、和间隙细胞)。在另一种实施方式中，可以用至少两种细胞的混合群体作为细胞系统，并且能用于数字矩阵。68.培养基培养基是能培养细胞的任何混合物。生长培养基是微生物或细胞在其中经历生长的客体。69.模拟本文所用的“模拟”或类似术语指执行参考对象的一种或多种功能。例如，分子模拟物执行分子的一种或多种功能。70.调节调节或其形式，是指提高、或降低、或维持通过细胞靶标介导的细胞活性。应当理解，在使用这些词语之一时，也公开了其可比对照提高1%、5%、10%、20%、50%、100%、500%、或1000%,或可以比对照降低 1%、5%、10%、20%、50%、或 100%。71.调节DMR信号“调节DMR信号”或类似术语是引起细胞响应分子刺激发生DMR信号或概况改变。72.调节比较“调节比较”或类似术语是初级概况和二级概况标准化的结果。73.调节概况“调节概况”或类似术语是分子存在时标记的二级概况和不存在任何分子时标记的初级概况之间的比较。例如，所述比较可以通过从二级概况中减去初级概况或从初级概况中减去二级概况或将二级概况对初级概况进行标准化。
74.调节剂调节剂或类似术语是指控制细胞靶标活性的分子，例如配体。它是结合细胞靶标，例如靶蛋白的信号调节分子。75.调节剂生物传感器指数“调节剂生物传感器指数”或类似术语是由就调节剂采集的数据生成的生物传感器指数，例如DMR数据。例如，调节剂生物传感器指数可以由调节剂作用于细胞组的概况、和调节剂针对标记组的调节概况构成，每组标记针对细胞组中的一种细胞。76.调节标记的生物传感器信号“调节生物传感器信号”或类似术语是引起细胞响应标记刺激发生生物传感器信号或概况改变。 77.调节剂DMR指数“调节剂DMR指数”或类似术语是通过就调节剂采集的数据生成的DMR指数。例如，调节剂DMR指数可以由调节剂作用于细胞组的概况、和调节剂针对标记组的调节概况构成，每组标记针对细胞组中的一种细胞。78.分子本文所用的术语“分子”或类似术语是指以化学分子或有确定分子量的分子的形式存在的生物或生物化学或化学实体。不论其大小，分子或类似术语是化学、生物化学或生物分子。很多分子属于称为有机分子(含有碳原子和其它原子，通过共价键连接的分子)的类型，尽管一些分子不含碳(包括简单的分子气体例如分子氧和更复杂的分子例如一些硫基聚合物)。通用术语“分子”包括大量描述性分子类型或分组，例如蛋白质、核酸、碳水化合物、类固醇、有机药物、小分子、受体、抗体和脂质。适当的时候，由于所述方法应用于分子亚组，本文中采用这些更具描述性的术语(其中很多，例如“蛋白质”，其本身描述了重叠的分子组)中的一个或多个，但不减损这些分子用作代表一般类别“分子”和指定亚类(例如蛋白质)的意图。除非明确说明，“分子”一词应包括特定的分子及其盐，例如药学上可接受的盐。79.分子生物传感器指数“分子生物传感器指数”或类似术语是由就分子采集的数据生成的生物传感器指数。例如，分子生物传感器指数可以由分子作用于细胞组的概况、和分子针对标记组的调节概况构成，每组标记针对细胞组中的一种细胞。80.分子DMR指标“分子DMR指数”或类似术语是通过就分子采集的数据生成的DMR指数。例如，分子生物传感器指数可以由分子作用于细胞组的概况、和分子针对标记组的调节概况构成，每组标记针对细胞组中的一种细胞。81.分子指数“分子指数”或类似术语是涉及分子的指数。82.分子混合物分子混合物或类似术语是指含有至少两种分子的混合物。所述两种分子可以是，但不限于，结构不同(即对映异构体)、或组成不同(例如，蛋白质同种型、糖形、或带有不同聚乙二醇(PEG)修饰的抗体)、或结构和组成不同(例如未纯化的天然提取物、或未纯化的合成化合物)。83.分子调节指数“分子调节指数”或类似术语是指显示分子对标记组作用于细胞组的生物传感器输出信号的调节能力的指数。通过将分子存在下受标记刺激后细胞应答的特定生物传感器输出信号参数对没有任何分子时的情况进行标准化而生成调节指数。84.经分子处理的细胞经分子处理的细胞或类似术语是已暴露于分子的细胞。85.分子药理学 分子药理学或类似术语是指分子作用于细胞的系统细胞生物学或系统细胞药理学或作用模式。通常通过(但不限于)毒性、影响特定细胞过程(例如，增殖、分化、活性氧物质信号转导)的能力、或调节特定细胞靶标(例如，P 2AR、ADRB2、ADRA1A、ADRA1B、ADRA1D、ADRA2A、ADRA2B、ADRA2C、ADRBI、ADRB3、P13K、PKA、PKC、PKG、JAK2、MAPK、MEK2 或肌动蛋白)的能力来鉴定分子药理学。86.天然细胞(Native cell)天然细胞是任何没有经过遗传工程改造的细胞。天然细胞能是原代细胞、永生细胞、转化细胞系、干细胞或干细胞衍生细胞。87.网络相互作用“网络相互作用”或类似术语是指至少两种特定信号转导级联反应或通路间的相互作用。例如，A431细胞内缓激肽B2受体的激活影响至少两种信号转导通路Gq和Gs通路，其中这两种通路能相互交叉调节。这种交叉调节就是一种网络相互作用。另一个例子是A431细胞内的EGFR信号转导，它涉及复杂的多组成信号转导通路。这些通路提供了反馈、信号扩增、和细胞内多种信号和信号转导通路之间相互作用的机会，这主要通过网络相互作用。88.标准化标准化或类似术语是指调整数据、或概况、或应答以例如消除至少一个共变量。例如，若产生了两种应答，一种针对作用于细胞的标记且一种针对作用于细胞的标记与分子，标准化是指比较没有分子时标记诱导的应答和存在分子时的应答，并消除后仅由标记引起的应答，使得标准化的应答代表由于分子对标记的调节造成的应答。通过在分子存在下标准化标记的初级概况和标记的二级概况(调节概况)得到调节比较。89.定靶药理学所述定靶药理学或类似术语涉及药物分子的活细胞或细胞系统作用在特定靶标上的性能和其相关效果。药物分子结合在活细胞或细胞系统、或不同条件下的相同细胞可以有不同效果的靶标。90.可选的“可选的”或“可选地”或类似术语表示随后描述的事件或情形可以发生或不发生，而且该描述包括事件或情形发生的实例和事件或情形不发生的实例。例如，短语“组合物可选包含组合”是指组合物可以包含不同分子的组合或不包含组合，从而说明书包括了组合和组合缺失(即组合中单独的成员)。
91.或本文所用的词语“或”或类似术语表示特定列表中的任意成员且还包括该列表中成员的任意组合。92.组组或类似术语是指预先确定的样本组(细胞、试验、或通路)。可以从库中选取样本产生组。在本公开的实施方式中，组能是试验组。93. pH缓冲试验溶液pH缓冲试验溶液是任何缓冲到具有生理pH (通常pH 7. I)的溶液。94.淘选淘选或类似术语是指筛选一种或多种细胞是否存在一种或多种受体或细胞靶标。95. “预定时域”“预定时域”或“时域”指在事件例如试验中的特定时间或时间段。例如，如本文所述，用于收集细胞暴露于分子时的数据的时域可以是刺激后0-3分钟、3-6分钟、6-10分钟、10-20分钟、20-50分钟、50-120分钟。在另一个示例中，如本文所述，用于收集细胞暴露于分子时的数据的时域可以是刺激后3、5、9、15和50分钟。因此，在事件中能有多个时域。例如，如本文所述，事件中可以有3-20、3-15、3-10、3-7和3_5个时域。96. “时间段”“时间段”是指代表时间推移的任何阶段。例如，I秒、I分钟、I小时、I天和I周都是时间段。97.刺激后刺激后或或类似术语是指在细胞试验中用分子刺激细胞后的时间。98.阳性对照“阳性对照”或类似术语是一种对照，其显示数据采集的条件能产生数据集合。99.效能效能或类似术语是用产生给定强度效应所需的量表述的分子活性的度量。效能与亲和性及功效成比例。亲和性是药物分子与受体结合的能力。100.增强增强、增强的或类似术语是指由分子引起的细胞内标记的生物传感器应答的特定参数提高。通过比较标记的初级概况和分子存在下相同标记在同一细胞内的二级概况，可以计算出分子对细胞的标记诱导生物传感器应答的调节。正调节是指分子引起标记诱导的生物传感器信号增加。101.初级概况“初级概况”或类似术语是指当分子接触细胞时产生的生物传感器应答或生物传感器输出信号或概况。通常，在将初始细胞应答对净零生物传感器信号(即基线)标准化以后获得初级概况。102.概况概况或类似术语是指就组合物，例如细胞采集到的数据。如本文所述，概况可以从无标记的生物传感器采集。103.出版物
整篇申请中引用了多个出版物。这些出版物的公开内容通过引用全文纳入本申请中以更完整地描述本申请所属领域的状态。所公开的参考文献也根据引用所依赖的讨论中包含的材料被单独地和具体地通过弓I用纳入本文。104.脉冲刺激试验“脉冲刺激试验”或类似术语可用于细胞仅暴露于分子中极短时间(例如，数秒、或数分钟)的情况。这种脉冲刺激试验可用于研究分子作用于细胞/靶标的动力学，及其对标记诱导的生物传感器信号的影响。可通过在添加分子后的给定时间用液体操作装置简单地将分子溶液替换成细胞试验缓冲液来完成脉冲刺激试验。105.静息静息或类似术语涉及处于静止、不动、静息、休眠、无活性的状态。静息可以指细胞周期中细胞的Gtl期；或静息是细胞不分裂时的状态。细胞静息定义为由多种抗有丝分裂信号例如促分裂原(如生长因子)撤去、接触抑制和粘着丧失)诱导的可逆生长/增殖停滞。 106.范围在本文中，范围可以表述为自“约”某一具体值始和/或至“约”另一具体值止。表述这样的范围时，另一种实施方式包括自某一具体值始且/或至另一具体值止。类似地，用先行词“约”将数值表示为近似值时，应该理解，该具体值构成另一个实施方式。应该进一步理解，各范围的端点不论与另一端点相关联还是独立于该端点，都是有意义的。还应理解，本文公开了许多数值，每个数值也在本文中公开为数值本身以外的“约”具体值。例如，如果公开数值“10”，那么也公开了“约10”。还应理解，当数值公开为“小于或等于”该值，“大于或等于”该值时，也公开如由技术人员适当理解的数值之间可能的范围。例如，如果公开数值“10”，则也公开了 “小于或等于10”以及“大于或等于10”。还应理解在通篇申请中，提供了许多不同格式的数据，这些数据代表终点和起点以及由这些数据点的任意组合的范围。例如，如果公开具体数据点“10”和数据点“15”，应理解，可以认为公开了大于、大于或等于、小于、小于或等于以及等于“10”和“15”、以及在10-15之间。还应理解，还公开了两个具体单位之间的每个单位。例如，如果公开10和15，则也公开了 11，12，13和14。107.受体受体或类似术语是指包埋在细胞的质膜或胞质内的，可以结合移动信号(或“信号”)的蛋白分子。与受体结合的分子称为“配体”，并可以是肽(例如神经递质)、激素、药物、或毒素，当发生这种结合时，受体发生的构象变化通常启动细胞应答。但是，一些配体只是阻断受体而不诱导任何应答(例如拮抗剂)。配体诱导的受体变化导致生理变化，这构成配体的生物活性。例如，受体能是3 2肾上腺素能(andrenergic)受体或a肾上腺素能受体。在进一步示例中，所述受体可以是 P 2AR、ADRB2、ADRA1A、ADRA1B、ADRA1D、ADRA2A、ADRA2B、ADRA2C、ADRBl 和 ADRB3。108.参照分子“参照分子”或“参比分子”或类似术语是指用于测定作用于细胞的测试分子影响的分子。参照分子可根据实验信息而不同。例如，在拮抗试验中，所述参照分子是与所述测试分子相互作用的靶标受体的激动剂。在顺序刺激试验中，所述参照分子能是与所述测试分子相互作用的靶标受体的激动剂、拮抗剂、或反向激动剂。在共刺激试验中，所述参照分子能是受体下游的通路调节剂，例如腺苷酸环化酶激活剂毛喉素。在调节试验中，所述参照分子能是通路调节剂，例如酪蛋白激酶2 (CK2)抑制剂TBB、或PI3K抑制剂LY294002、或ROCK抑制剂Y27632、MEK抑制剂U0126、或毒素(例如，百日咳毒素、霍乱毒素)。109. “代表特定人生理或病理生理”“代表”或类似术语是某种类型或种类物品的示例或典型。例如，认为人肺癌细胞系A549的细胞特征代表人肺癌的生理；因此，A549用作研究人肺癌的细胞生物学和生理学的模型细胞系。110.应答应答或类似术语是对任何刺激的任何反应。111. “强生物传感器信号”“强生物传感器信号”是幅度显著超过噪音水平或阴性对照应答(例如3x, 10x, 20x, IOOx,或IOOOx)的生物传感器信号。阴性对照应答通常是添加试验缓冲溶液 (即载剂)后细胞的生物传感器应答。噪音水平是不另外添加任何溶液时细胞的生物传感器信号。值得注意的是，在添加任何溶液前，细胞总是被溶液覆盖。112. “强 DMR 信号”“强DMR信号”或类似术语是指“强生物传感器信号”的DMR形式。113.样品样品或类似术语是指按本文所述进行试验的动物、植物、真菌等；天然产物、天然产物提取物等；动物的组织或器官；细胞(在对象内的、或直接取自对象、或在培养物中维持的细胞或来自培养细胞系的细胞);细胞裂解物(或裂解物的部分)或细胞提取物；或含有一种或多种来自细胞或细胞材料的分子(例如多肽或核酸)的溶液。样品还可以是含有细胞或细胞组分的体液或分泌物(例如但不限于血液、尿液、粪便、唾液、泪液、胆汁)。114. 二级概况“二级概况”或类似术语是指细胞在分子存在时响应标记的生物传感器应答或生物传感器输出信号。二级概况可以用作分子对标记诱导的细胞应答或生物传感器应答的调节能力的指示剂。115.包含血清的培养基包含血清的培养基或类似术语是任何包含血清(例如胎牛血清)的细胞培养基。胎牛血清(胎牛血清(fetal calf serum))是血液凝结后留有血衆的部分,在这过程中血衆蛋白纤维蛋白原转化成纤维蛋白和凝块后的残留。胎牛血清通过屠宰中封闭系统静脉穿刺从未出生胎牛流出的血中获得。胎牛血清(FBS)是最广泛应用的血清，因为抗体含量低并且包含更多的生长因子，在很多不同应用中有多用性。FBS用于培养真核细胞。116.血清耗尽的培养基血清耗尽的培养基是任何不包含血清的细胞培养基。117. “短时间段”短时间段或类似术语是通常为1-30分钟的时间段。118.短期试验“短期试验”或类似术语用于研究给定分子对活细胞的短期影响。一种具体的短期试验是“短期生物传感器细胞试验”。在一种实施方式中，每个类型的细胞仅暴露于所述分子中一段短的时间(例如，5分钟、10分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、180分钟、240分钟)。这一短期试验常用于检测早期细胞信号转导响应，其可直接用于研究分子诱导的细胞信号转导事件或通路或研究分子对标记诱导的细胞响应的调节能力。119.信号转导通路“确定的通路”或类似术语是指从接收信号(例如外源配体)到细胞应答(例如细胞靶标表达的提高)的细胞通路。在一些情况中，配体与受体结合导致的受体激活与细胞对配体的应答直接偶联。例如，神经递质GABA能激活作为离子通道一部分的细胞表面受体。GABA与神经元上GABA A受体的结合打开了作为受体一部分的氯选择性离子通道。GABA A受体激活使带负电的氯离子能移动进入神经元从而抑制神经元产生动作电位的能力。但是，对于很多细胞表面受体，配体受体相互作用不直接与细胞应答关联。在配体产生对细胞行为的最终生理效应之前，激活的受体必须首先与细胞内的其它蛋白质相互作用。通常，一系列相互作用的细胞蛋白质的作用在受体激活后发生改变。由受体激活诱导的整套细胞变化称为信号转导机理或通路。信号转导通路可以比较简单或相当复杂。120. “特定一时间段” “特定一时间段”或类似术语指两个事件之间的特定一时间段。例如，如本文公开，在两步试验中，所述细胞首先暴露于分子，然后用受体激动剂刺激。所述两个步骤由一个特定时间段分开。例如，如本文公开，对无标记细胞试验，所述时间能是 I小时。121.禁食细胞禁食细胞或类似术语指细胞培养中使细胞进入静息的过程。细胞培养期间从细胞培养基中撤去促分裂原(如血清或生长因子)是使细胞禁食的最常见方式。撤去促分裂原可以与其他方式(如接触抑制)联用。122.物质物质或类似术语是任何物理实体。材料是物质。分子、配体、标记、细胞、蛋白质和DNA可认为是物质。机器或制品应视为由物质组成，而本身不视为物质。123.同步细胞同步细胞或类似术语指细胞群，其中微量滴定板的单个孔中大部分细胞处于相同状态(例如，相同细胞周期(如Gtl或G2))。同步细胞或类似术语也指控制细胞周围环境或细胞生长的条件，产生大部分细胞处于细胞周期内同一阶段的细胞群。124.稳定在用于药物组合物时，术语“稳定”或类似术语一般在本领域理解为表示于特定保存条件下经过给定时间段后活性成分的损失低于一定量，通常为10%。组合物被认定为稳定所需要的时间与各产品的用途有关，并由以下商业化实践所确定生产所述产品、锁定产品用于品质控制和检查、运送给批发商或直接到消费者处，其中所述产品在其最终使用前被再次保存。包括数月时间的安全因子在内，药物的最短产品寿命一般是一年，优选超过18个月。本文所用术语的“稳定”参考了这些市场现实和在容易实现的环境条件例如2° C-8° C冷藏条件下保存与运输产品的能力。125.对象全文中使用的对象或类似术语是指个体。因此，“对象”可以包括，例如驯养的动物如猫、狗等，牲畜(例如，牛、马、猪、绵羊、山羊等)、实验室动物(例如，小鼠、兔子、大鼠、豚鼠等)和哺乳动物、非人哺乳动物、灵长类动物、非人灵长类动物、啮齿动物、鸟、爬行动物、两栖动物、鱼和任何其它动物。在一个方面，对象是哺乳动物，例如灵长动物或人。对象可以不是人。126.悬浮细胞“悬浮细胞”是指优选在培养基中培养的细胞或细胞系，其中细胞在培养过程中不附着或粘着在基底表面。但是，悬浮细胞通常可以通过化学(例如共价结合、或抗体-细胞表面受体相互作用)、或物理方式(例如，由于重力作用沉降到包埋了生物传感器的孔底部)与生物传感器表面接触。因此，悬浮细胞也可用于生物传感器细胞试验。127.系统生物学“系统生物学”或类似术语是指在生物学过程发挥作用的复杂生理环境中对这些过程的‘系统化’调查。 128.系统药理学“系统药理学”或类似术语是指用系统生物学探索药理学目标。129.测试分子测试分子或类似术语是指在获得该测试分子信息的方法中使用的分子。测试分子可以是未知分子或已知分子。130.处理处理或治疗或类似术语可至少以两种方式使用。首先，处理或治疗或类似术语可以指给予或作用于对象，操作对象。其次，处理或治疗或类似术语可以指将任何两种物品，例如任何两种或多种物质如分子和细胞,混合到一起。这种混合将至少两种物质汇集到一起使它们之间发生接触。例如，“处理细胞达到高融合度”指处理或操作细胞使其达到高融
I=I /又 o当处理或治疗或类似术语用于有疾病的对象时，并不意味治愈或甚至例如症状的减轻。当术语治疗或类似术语与处理或治疗或类似术语联用时，表示潜在疾病的症状被减轻，和/或一种或多种潜在的细胞、生理、或生化病因或引起症状的机理被减轻。应当理解，本文使用的减轻表示相对于疾病的状态，包括疾病的分子状态，而不仅指疾病的生理状态。131.引发引发或类似术语是指引起或启动事件如应答的行为。132.两步试验“两步试验”或类似术语是指，细胞组中的每种细胞先暴露于分子以研究分子诱导的生物传感器信号，然后通过特定的标记或一组标记研究分子调节标记诱导的生物传感器信号的能力。这一试验可称为双模式试验如初始的激动模式和后续的拮抗模式，分子的作用模式(例如，靶向、激动和拮抗、和效力或有效性)。133.超高融合度超高融合度或类似术语指在细胞培养结束时至少有99%融合度的细胞群。134.未知分子未知分子或类似术语是具有未知生物/药理/生理/病理生理活性的分子。135.数值就组分、成分、添加剂、细胞类型、标记和类似方面公开的具体和优选数值及其范围仅用于说明，它们不排除其它定义数值或定义范围内的其它数值。本发明的组分、设备和方法包括具有本文所述任何数值或任何数值组合、具体数值、更具体数值和优选数值的组分、设备和方法。因此，所公开的方法、组合物、制品、和机器可以包含或由其组成、或基本由其组成的方式联合本文讨论的不同组分、步骤、分子和组合物等。例如，它们可用于本文定义的分子(包括配体)的鉴定方法；本文定义的产生指数的方法；或本文定义的药物开发的方法。136.弱贴壁细胞“弱贴壁细胞”是指在细胞培养中与基底表面相互作用、结合、或接触较弱的细胞或细胞系或细胞系统，例如原核或真核细胞。但是，这些类型的细胞，例如人胚胎肾(HEK)细胞通过清洗或培养基交换的物理扰动方式从基底表面脱离。137.细胞信号转导波“细胞信号转导波”或类似术语指细胞中信号转导的不同时期和改变。例如，“细胞信号转导波”包括但不限于，起始第二信使相关事件、中间信号转导事件(如运输)、细胞形态变化、蛋白从头合成相关事件或基因表达调节和改变相关事件。D.实施例I.实验过程a)试剂所有肾上腺素能受体(adrenergic receptor)药物获自生物分子国际公司(BioMol International, L. P.)(宾夕法尼亚州的普利茅斯会议市)。表皮生长因子(EGF)获自巴亨美洲公司(BaChem Americas Inc.)(加利福尼亚州托兰斯市)。所有的细胞培养试剂购买自吉布可公司(GIBCO)细胞培养产品。细胞培养相容性Epic 384生物传感器微孔板获自康宁公司(纽约州康宁)。b)细胞培养人表皮样癌A431细胞系购买自美国典型培养物保藏中心(ATCC)(弗吉尼亚州马纳萨斯)，并根据ATCC说明书维持。所述细胞培养基是补充有10%胎牛血清(FBS)、每升4. 5g葡萄糖、2mM谷氨酰胺、和抗生素的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)。细胞通常在生物传感器微孔板中生长，每孔中约l_2xl04个3-15次传代的细胞悬浮在50iil相应的培养基中，并在37° C和空气/5%C02下培养约I天。A431细胞通常在血清培养基中培养一天，然后在无血清培养基中禁食过夜。所有细胞在试验时的融合度为约95%-100%。通过对培养一天的A431细胞用100ng/ml PTX处理过夜而获得经PTX处理的A431细胞。c)光生物传感器系统和细胞试验使用Epic 0版本波长解调系统(纽约州康宁的康宁公司)进行全细胞感测。该系统由温度控制单元、光学检测单元、和用机器人的机载液体操作单元组成。所述检测单元以集成光纤为核心，能以约15秒的时间间隔对细胞应答进行动力学测量。RffG生物传感器能检测传感器表面附近的局部折射率的微小变化。由于细胞内局部折射率随密度及其生物物质(例如，蛋白质，分子复合物)分布而变化，生物传感器利用其渐消波非侵入性地检测天然细胞内配体诱导的动态质量再分布。渐消波延伸入细胞并随距离呈指数衰减，产生约150纳米的特征感测容量，提示任何通过受体激活介导的光应答仅代表进行渐消波取样的细胞部分的平均值。受体激活下游许多细胞事件的集合确定配体诱导DMR的动力学和幅度。对于生物传感器细胞试验,通过用HBSS (Ix汉克斯平衡盐溶液(Hanks balancedsalt solution)，添加20mM Hepes, pH 7. I)稀释保存的浓缩溶液制得分子溶液，并转移到384孔聚丙烯分子保藏板以准备分子源板。当进行两步试验时，分别制备分子和标记的源板。平行地，细胞用HBSS清洗两次并保持在30 ill HBSS中以准备细胞试验板。然后将细胞试验板和分子与标记源板在读板系统的厢内孵育。孵育约I小时后，记录细胞试验微孔板中所有生物传感器的波长基线并标准化到O。然后，进行2-10分钟连续记录以确立基线，并确保细胞达到稳态。随后，通过用机载液体处理器将IOiU标记溶液吸入细胞试验板来引发细胞应答。为研究分子对标记诱导应答的影响，用固定剂量(一般为EC80或EC100)的标记进行第二刺激。在第二刺激开始前，再次标准化微孔板中所有生物传感器的共振波长以确立 第二基线。两次刺激通常分隔约I小时。所有研究在受控温度(28° C)下进行。进行至少两组独立实验，各组至少有三个重复样。发现试验的变异系数为〈10%。如使用Epic系统测量的典型细胞DMR信号是实时动力学反应，由基线刺激前(经常标准化到零)和刺激后细胞反应组成。2.实施例I :多个鉴定P 2AR激动剂沙丁胺醇的试验A431细胞用作模式系统来全面鉴定肾上腺素能受体药物分子的定靶药理学。使用定量实时PCR的基因表达分析发现A431细胞只表达P 2肾上腺素能受体(P 2AR，ADRB2),但是a肾上腺素能受体(40狀认、40狀18、40狀10、40狀24、40狀28、々0狀20或其他P2肾上腺素能受体(ADRBl、ADRB3)很少或没有(数据未显示)。在激动试验中，10 U M沙丁胺醇在静息A431细胞中生成经典的Gs-DMR信号，以快速N-DMR和随后的慢P-DMR事件为特征(图1A)。这显示在A431细胞中，沙丁胺醇作为强激动剂。用10 ii M沙丁胺醇预刺激A431细胞改变普萘洛尔DMR信号(图1B)。普萘洛尔是ERK通路的部分激动剂，并是腺苷酸环化酶-cAMP-PAK通路的反向激动剂。在静息A431细胞中，普萘洛尔产生可检测的P-DMR信号。然而，沙丁胺醇处理的A431细胞对普萘洛尔的响应有N-DMR信号。这显示普萘洛尔能逆转沙丁胺醇诱导的P-DMR信号。对两种测量而言，普萘洛尔浓度是10 U M0静息A431细胞用毛喉素(10 ii M)和沙丁胺醇(10 y M)共刺激产生不同于毛喉素DMR信号的DMR信号，所述共刺激产生更大N-DMR，和有更低动力学的更小P-DMR (图1C)。毛喉素是熟知的腺苷酸环化酶激活剂，并且在A431细胞中10 y M毛喉素能完全激活Gs通路。这显示沙丁胺醇引起补偿通路(如ERK)激活来弥补毛喉素介导的Gs信号转导通路。IOnM肾上腺素预处理的A431细胞仍然响应沙丁胺醇，但是相对未处理的A431细胞，响应要小得多(图1D)。这显示一旦细胞通过内源性P 2AR由肾上腺素完全激活，沙丁胺醇用作强部分激动剂并且仍然能轻微逆转肾上腺素响应。所述CK2抑制剂TBB预处理细胞大幅改变沙丁胺醇DMR信号，在10 u MTBB处理细胞中，所述沙丁胺醇DMR信号缺乏起始N-DMR事件并且仅由受抑制P-DMR事件组成(图IE )。这显示CK2激酶是A431中P2AR信号转导的下游级联反应，并且在N-DMR事件中起主要作用，也对沙丁胺醇DMR信号的P-DMR事件有影响。
lOOng/ml PTX处理的A431细胞响应沙丁胺醇的DMR信号与对照细胞相似，但是加速P-DMR事件(图1F)。这显示用PTX预调理A431改变细胞背景，并且造成P 2AR信号的改变。用10 ii M沙丁胺醇预刺激A431使细胞对IOnM肾上腺素的第二刺激脱敏(图1G)。所述结果再次证实沙丁胺醇作为P 2AR的强激动剂起作用。沙丁胺醇对4个不同标记的调节指数示于图1H。所述结果显示用10 PM沙丁胺醇预处理细胞完全抑制肾上腺素DMR，增前Gi偶联GPR109A激动剂烟酸DMR，对EGFR激动剂EGF DMR影响很小并且部分减弱Gq偶联HlR激动剂组胺DMR。因为P2AR可发生同源脱敏，激活P2AR引起细胞内cAMP水平增加，进而增强Gi介导的信号转导(即异源致敏)，并且@ 2AR激活也与抑制Gq信号转导的Gq介导通路之间有交叉(cross-talk)。3.实施例2 :肾上腺素能受体药物的无标记定靶药理学鉴定为研究无标记定靶药理学方法的潜能，使用已知的肾上腺素能受体药物。表I包含所有当前市场上已知的肾上腺素能受体药物，和其相应的治疗适应症。除了坦洛新之外，其他都市售可得，并且使用本公开方法检测。主要结果概括于图2的热图。表I市售肾上腺素能受体药物，其靶标和适应症
权利要求
1.一种测定分子定靶药理学的方法，所述方法包含步骤 a.收集来自试验模式组的生物传感器反应； b.分析所述生物传感器反应；和 c.测定所述分子的所述定靶药理学。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述生物传感器反应是无标记生物传感器反应。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法由2-10种试验模式组成。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述试验模式选自持续激动刺激试验、拮抗试验、顺序刺激试验、反向顺序刺激试验、共刺激试验、调节试验和调节概况试验。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述试验模式选自持续激动刺激试验、顺序拮抗试验、反向顺序刺激试验、有通路调节剂的共刺激试验和不同通路标记组的调节。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述一种或多种试验从预定时域收集数据。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法有3-20、3-15、3-10、3-7或3_5个时域响应。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在刺激后0-3分钟、3-6分钟、6-10分钟、10-20分钟、20-50分钟和50-120分钟测定所述时域响应。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述时域响应覆盖细胞信号转导中不同的波。
10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在刺激后3、5、9、15和50分钟测定所述时域响应。
11.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述分析生物传感器反应包含数字描述DMR信号。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法还包含将以数字的描述DMR信号排序成数字矩阵。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述数字矩阵通过运行聚类算法分析而生成。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述聚类算法分析是一维或二维聚类算法分析。
15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述聚类算法是分级、K均值或马尔可夫聚类算法。
16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述聚类算法是分级聚类算法。
17.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述分级使用最大配对关联来关联各组。
18.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述聚类算法使用欧几里德距离。
19.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述聚类呈热图的形式。
20.一种重新定位测试分子的方法，所述方法包含步骤 a.收集来自试验模式组的所述测试分子的生物传感器反应； b.分析所述测试分子的所述生物传感器反应； c.测定所述测试分子的所述定靶药理学； d.聚类作用于同一靶标的所述测试分子和现有药物分子来鉴定药物分子定靶药理学的最接近匹配；和 e.重新定位所述测试分子以指示最接近匹配的药物分子。
全文摘要
公开了使用无标记生物传感器细胞试验和无标记生物传感器整合药理学来测定分子定靶药理学的方法和机器。
文档编号G06F19/00GK102812468SQ201180014608
公开日2012年12月5日 申请日期2011年3月18日 优先权日2010年3月19日
发明者方晔, A·M·菲里 申请人:康宁股份有限公司