专利名称：用于将图像换算成不同曝光时间的方法
技术领域：
本发明一般来说涉及用于将在给定曝光时间拍摄的图像换算成选择或不同的曝光时间的方法。
背景技术：
在用荧光标记染色的生物样本的数字成像的领域中，出现比较用不同曝光时间拍摄的相同视场的图像的需要。在一个情形中，存在对从生物材料的样本去除自发荧光的需要。生物材料的样本典型地包含在与用于对组织样本检查某些生物特征所通常使用的荧光标记的频率范围重叠的频率范围上发荧光的物质。例如，相当常见的是，用与诸如Cy3和Cy5的已确立的荧光染料共轭的感兴趣的蛋白质的抗体将样本染色。例如，人类乳腺癌组织可用与Cy3共轭的p53肿瘤抑制·蛋白质的抗体来染色。从用这样的荧光标记染色的组织的显微图像去除自发荧光的一个方式将在用该荧光标记染色之前拍摄相同视场的图像，并且然后在逐个像素的基础上从染色的图像去除在未染色图像中观察的信号强度。期望的结果是其中在荧光标记的通道中记录的荧光信号正是由于荧光标记的结合引起的校正图像。然而，为了使这样的扣除产生正确的图像，两个图像应该具有大致上相同的曝光时间。存在其中在相同的曝光时间拍摄自发荧光图像和荧光标记染色图像是不便或不可能的情形。一般而言，每个类型的图像具有它自己的最佳曝光时间，其给出从最大数量的像素获得信号与避免来自使它的记录通道饱和的任何像素的信号之间的最好平衡，以及真实信号和背景信号之间的最好平衡。在一些情况下，与一些荧光标记一起使用长达对于测量自发荧光可期望的曝光时间可是不可能或不实际的，因为在这样的长曝光时间，不可接受的大量像素被饱和，意味它们接收如此多的信号以致另外的信号不可检测。因此，存在对估计如果曝光时间不同，荧光图像的像素处的信号将会是什么的需要。已经有通过使用式 |2 二 |Ι心2Λ0这样做的尝试，其中Itl是曝光时间的强度并且It2是曝光时间t2的估计强度。然而，这样估计的结果不是完全令人满意的。已经有通过根据式It2= KItl-在^的背景(在t2的背景)扣除每个曝光时间的背景来对该估计进行改进的尝试，但这些估计仍然没有像期望的那样准确。
发明内容
本发明的方法和系统提供来自在给定曝光时间的显微镜样本的荧光图像的像素的信号的强度的准确估计，其使用用于拍摄实际图像的数字摄像机的暗像素强度来开始于在不同曝光时间的实际信号强度。用于将在最佳曝光时间拍摄的图像换算成选择的曝光时间的方法的示例一般包括:确定成像装置的暗像素强度；在最佳曝光时间采集第一图像；以及对于不同于该最佳曝光时间的第二曝光时间至少部分基于该暗像素强度调节该第一图像中的一个或多个像素的像素强度。确定该暗像素强度可包括将曝光时间设置成零；采集强度图像；以及计算整个强度图像的平均强度。该最佳曝光时间典型地至少部分基于该成像装置的一个或多个设置。在一个示例中，第一图像是生物材料的，其中该生物材料可被染色或另外包括第一生物标记。该生物标记可包括荧光生物标记，由此该生物材料的第一图像将展现对应于该生物标记的荧光通道中的信号。该生物材料可用第二生物标记染色，由此该方法可进一步包括在相同或不同的最佳曝光时间拍摄第二图像。该方法可进一步包括对于不同于最佳曝光时间的第二曝光时间，至少部分基于暗像素强度调节第二图像中的一个或多个像素的像素强度。该第一和第二图像可重合来形成合成图像。这些图像可例如通过识别一个或多个形态特征并且使用这些识别的形态特征对齐或共同重合这些图像而重合。这些图像也可使用例如但不限于对齐这些图像的像素的其他方法而重合。该方法可进一步包括采集生物材料的自发荧光图像，并且在一些示例中从第一图像扣除生物材料的该自发荧光图像。该自发荧光图像也可与第一和/或第二图像重合。这些方法不限于采集第一和第二图像。可拍摄该材料的任何数量的图像并且根据给定使用的需要或期望换算和/或重合。这些图像中的任何两个或多个可重合来形成合成图像。这些方法还可包括用于对生物材料染色或将一个或多个生物标记另外应用到生物材料的步骤，其中第一图像在该生物标记应用到生物材料后采集。生物标记可适应于一个或多个通道。生物标记可同时或连续应用到材料。图像可使用对应于生物标记通道的滤光器拍摄。
当下列详细描述参照附图(其中类似的符号在整个图中表示类似的部件)阅读时，本发明的这些和其他特征、方面和优点将变得更好理解，其中:
图1是与数字成像装置关联的曝光时间和暗帧的平均像素强度之间的相关性的示例的曲线 图2A是具有200 msec的曝光时间的图像；
图2B是具有500 msec的曝光时间的图2A的图像；
图2C是图2A和2B的像素强度的散点图；以及 图3是曝光时间对给定感兴趣区的像素强度的影响的示例的曲线图。
具体实施例方式本发明的方法和系统的示例中的一个或多个提供来自在给定曝光时间的显微镜样本的荧光图像的像素的信号的强度的准确估计，其使用用于拍摄实际图像的数字摄像机的暗像素强度开始于在不同曝光时间的实际信号强度。自发荧光图像和染色图像常常在不同的曝光时间捕捉，但图像扣除要求两个图像使用相同的曝光时间获得。像素强度一般与曝光时间成线性，只要在摄像机的线性范围采集图像，但典型地存在由该摄像机设置的截距。为了该描述的目的，该截距称为暗像素强度。该暗像素强度是在没有光和零曝光时间的条件下的像素强度。暗像素强度由摄像机的读出噪声(电子/像素)、增益和DC偏置确定。通过知晓或另外确定图像采集设置的暗像素强度，在一个曝光时间采集的图像可线性换算成在不同曝光时间的图像。暗像素强度可例如通过在没有光和最小的曝光时间获得图像或通过由在一系列曝光时间捕捉图像间接计算强度而测量。曝光时间是荧光显微镜图像采集期间的参数，并且一般从若干毫秒变化到几秒，但它不一定限于该范围。正确的曝光时间对于维持荧光信号的线性表现是重要的。然而，存在其他也影响数字图像的采集期间的参数，其包括但不限于模拟增益、数字增益、偏置和重新分级。用于将在最佳曝光时间拍摄的图像换算成选择的曝光时间的方法的示例一般包括:确定成像装置的暗像素强度；在最佳曝光时间采集第一图像；以及对于不同于该最佳曝光时间的第二曝光时间至少部分基于该暗像素强度调节该第一图像中的一个或多个像素的像素强度。确定该暗像素强度可包括将曝光时间设置成零；采集强度图像；以及计算整个强度图像的平均强度。该最佳曝光时间典型地至少部分基于该成像装置的一个或多个设置。在例如当给定成像装置不能设置在零曝光时间时的情形中，曝光时间可外推到零或可设置在给定成像装置可允许的最低可能的设置。当计算平均强度时，暗像素强度的单个值可一维地应用。它可扩展到二维矩阵，例如当在零曝光时间采集图像时。图像也可被平均。例如，补偿滤光器可是标量或数组值。在一个示例中，第一图像是生物材料的，其中该生物材料可被染色或另外包括第一生物标记。该生物标记可包括荧光生物标记，由此该生物材料的第一图像将展现对应于该生物标记的荧光通道中的信号。该生物材料可用第二生物标记染色，由此该方法可进一步包括在相同或不同的最佳曝光时间拍摄第二图像。该方法可进一步包括对于不同于最佳曝光时间的第二曝光时间至少部分基于暗像素强度调节第二图像中的一个或多个像素的像素强度。该第一和第二图像可重合来形成合成图像。最后的图像也可从两个或更多图像计算，例如一个图像可从另一个图像扣除。这些图像可例如通过识别一个或多个形态特征并且使用这些识别的形态特征对齐或共同重合这些图像而重合。这些图像也可使用例如但不限于对齐这些图像的像素的其他方法而重合。该方法可进一步包括采集生物材料的自发荧光图像，并且在一些示例中从第一图像扣除生物材料的该自发荧光图像。该自发荧光图像也可与第一和/或第二图像重合。这些方法不限于采集第一和第二图像。可拍摄该材料的任何数量的图像并且根据给定使用的需要或期望换算和/或重合。这些图像中的任何两个或多个可重合来形成合成图像。这些方法还可包括用于对生物材料染色或另外应用一个或多个生物标记的步骤，其中第一图像在该生物标记应用到生物材料后采集。生物标记可适应于一个或多个通道。生物标记可同时或连续应用到材料。图像可使用对应于生物标记通道的滤光器拍摄。可在这些方法和系统中使用显微镜来收集由荧光团发射的光子并且将它们转送到成像装置，例如电荷耦合装置(CXD)摄像机或检测器。CXD阵列检测器将光子转换成光电流，其进而转换成电压。阵列中的每个检测器电压最终数字化(A/D转换，例如，模拟增益和数字增益)成代表光子强度的像素值。大多数科学级CCD摄像机具有12比特输出，其中像素值从O变化到4095。量子效率(Qe)和噪声都影响CXD检测器灵敏度。没有由CXD捕捉的光子一般视为损耗并且导致降低的灵敏度。噪声常常概况成三个分量:1)对于光电检测器是固有的暗噪声指在没有入射光子下形成的杂散信号(主要是热产生的);2)光子噪声，其指产生于光子的随机到达的光电流中的统计波动；以及3)读出噪声(也称为读取噪声)，其指由将光电流转换成数字字的组件产生的组合噪声。这些噪声分量可共同称为摄像机噪声，并且代表可在量化C⑶上的电子信号的过程期间引入的误差。信噪比(SNR)由以下确定:
权利要求
1.一种用于将在最佳曝光时间拍摄的图像换算成选择的曝光时间的方法，包括， 确定成像装置的暗像素强度； 在最佳曝光时间采集第一图像；以及 对于不同于所述最佳曝光时间的第二曝光时间，至少部分基于所述暗像素强度调节所述第一图像中的一个或多个像素的像素强度。
2.如权利要求1所述的方法，其中，确定所述暗像素强度包括， 将曝光时间设置成零； 采集强度图像；以及 计算整个强度图像的平均强度。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述最佳曝光时间至少部分基于所述成像装置的一个或多个设置。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一图像包括生物材料的荧光显微术图像。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述生物材料包括第一生物标记。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述生物标记是荧光生物标记。
7.如权利要求4所述的方法，其中，所述生物材料的所述第一图像展现荧光通道中的信号。
8.如权利要求5所述的方法，其中，所述生物材料包括第二生物标记，其进一步包括在相同或不同的最佳曝光时间 拍摄第二图像。
9.如权利要求8所述的方法，进一步包括:对于不同于所述最佳曝光时间的第二曝光时间，至少部分基于所述暗像素强度调节所述第二图像中的一个或多个像素的像素强度。
10.如权利要求9所述的方法，进一步包括使所述第一和第二图像重合来形成合成图像。
11.如权利要求4所述的方法，进一步包括采集所述生物材料的自发荧光图像。
12.如权利要求11所述的方法，进一步包括从所述第一图像扣除所述生物材料的所述自发荧光图像。
13.如权利要求12所述的方法，进一步包括将生物标记应用到所述生物材料，其中在所述生物标记应用到所述生物材料后采集所述第一图像。
14.如权利要求13所述的方法，进一步包括使所述自发荧光图像和所述第一图像重口 ο
15.如权利要求12所述的方法，进一步包括将另一个生物标记应用到所述生物材料，并且采集所述生物材料的第二图像。
16.如权利要求15所述的方法，进一步包括使所述第一图像和所述第二图像重合。
17.如权利要求15所述的方法，进一步包括:将一个或多个另外的生物标记应用到所述生物材料，所述一个或多个另外的生物标记各自对应于通道；并且对所述生物标记通道中的每个采集一个或多个另外的图像。
18.如权利要求17所述的方法，进一步包括使所述第一、第二和另外的图像重合来形成所述通道的合成图像。
19.如权利要求1所述的方法，其中，调节所述像素强度至少部分使用下面的等式:
全文摘要
用于将在最佳曝光时间拍摄的图像换算成选择的曝光时间的方法一般来说包括确定成像装置的暗像素强度；在最佳曝光时间采集第一图像；以及对于不同于最佳曝光时间的第二曝光时间，至少部分基于暗像素强度调节第一图像中的一个或多个像素的像素强度。
文档编号G06T5/40GK103221974SQ201180057390
公开日2013年7月24日 申请日期2011年11月29日 优先权日2010年11月30日
发明者R.J.菲尔金斯, Z.庞 申请人:通用电气公司